牡丹葉片氣孔觀察方法的比較研究

方純嬌，韓 雪，史冬燕，楚德昌

(菏澤學院生命科學系，山東菏澤 274015)

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牡丹葉片氣孔觀察方法的比較研究

方純嬌，韓 雪，史冬燕*，楚德昌

(菏澤學院生命科學系，山東菏澤 274015)

摘要[目的]用5種不同方法制取牡丹葉下表皮制片并對其氣孔進行比較研究。[方法]采用直接撕皮法、撕皮-刮去葉肉細胞法、NaOH離析法、過氧化氫-冰醋酸離析法和煮沸撕取法制取牡丹葉下表皮，對其制片指標進行了比較，并篩選出最佳染色劑。 [結果] 撕皮-刮去法和過氧化氫-冰醋酸離析法的制片效果較好，葉肉殘留少、真實性強。0.5%的I-KI染液染色效果好。[結論]該研究結果可為今后不同品種牡丹葉表皮的微形態特征研究奠定基礎。

關鍵詞牡丹；氣孔；觀察方法；氣孔密度

氣孔是調節植物多種生理功能的重要器官，對植物的光合、呼吸、蒸騰等生理活動起著重要的調節作用[1]。植物葉片氣孔的密度、大小、分布及運動規律對研究植物的適應性和抗逆性有重要作用[2]。許多學者對植物葉表皮氣孔的顯微特征研究發現葉表皮氣孔形態在植物種質資源多樣性、植物遺傳變異、分類學及植物與其地理環境的關系方面有著重要意義[3-8]。

牡丹(Paeoniasuffruticosa)為芍藥科芍藥屬植物的多年生落葉小灌木，素有“花中之王”的美譽。牡丹不僅有觀賞價值，而且具有食用和藥用價值。目前對牡丹的研究大多集中在葉片的解剖學結構[9]、光合性特征[10]、愈傷組織誘導[11]以及原生質體分離條件[12]等方面，但有關牡丹葉表皮獲取方法研究則鮮見報道。筆者采用5種不同方法制取牡丹葉下表皮制片，并對其氣孔進行比較研究，探索一種耗時短、操作簡單、結果真實性強的牡丹葉下表皮制片方法，以期為今后不同品種牡丹葉表皮的微形態特征研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料牡丹葉片于2014年采自菏澤學院生物園。

1.2制片方法

1.2.1直接撕皮法。用鑷子直接撕取葉片中部的下表皮(避開主要葉脈)，在載玻片上滴2滴蒸餾水，用毛筆將表皮展平，蓋上蓋玻片，壓平后進行鏡檢。

1.2.2撕皮-刮去葉肉細胞法。將鑷子撕取的葉下表皮置于帶蒸餾水的載玻片上，用手術刀輕輕刮去殘余葉肉細胞，再制片并觀察。

1.2.3煮沸撕取法。采取同一牡丹上相對位置和大小相近的成熟葉片，洗凈后選葉片中間部分連同葉脈剪成數段，每段約2 cm×2 cm。將處理好的牡丹葉片放入沸水中直至葉片變成深綠色，避開葉脈撕取葉下表皮，制片并觀察。

1.2.4NaOH離析法。采取同一牡丹上相對位置和大小相近的成熟葉片，洗凈后選葉片中間部分連同葉脈剪成數段，面積約為2 cm×2 cm。將處理好的葉片用5%NaOH浸泡處理7～8 h，用清水漂洗干凈后，用鑷子撕取葉脈外的葉下表皮制片觀察。

1.2.5過氧化氫-冰醋酸離析法。采取同一牡丹上相對位置和大小相近的成熟葉片用H2O2-HAC(1∶1)離析液浸泡解離9～10 h，取出后用清水漂洗干凈撕取葉下表皮，制片并觀察。

1.3染色液的處理 將撕取的葉下表皮在載玻片上展平后分別用0.5%的I-KI染液、0.5%番紅染液和1%番紅染液染色3～5 min，壓平后迅速進行鏡檢并拍照。

1.4氣孔形態的比較觀察 每個樣品隨機選20個視野，于40倍物鏡下測量氣孔器的長軸和短軸。每個樣品隨機取30個視野，計算每個視野內的氣孔數，除以視野面積，計算氣孔密度(個/mm2)。利用數碼顯微鏡攝像系統(Olympus BX53)，圖像處理系統使用Cellsens Standard軟件測量，用Excel 2003進行數據統計與分析。

2結果與分析

2.15種獲取方法的制片指標比較從表1和圖1可以看出，直接撕皮法和撕皮-刮去法制片時間短，需要1～2 min；其次是煮沸撕取法；但是， NaOH離析法、H2O2-HAC離析法需要8～10 h。撕皮-刮去法和H2O2-HAC離析法殘留葉肉細胞最少，清晰度最高；其次是直接撕皮法。從取樣能力和定位性來看，煮沸撕取法、NaOH離析法和H2O2-HAC離析法較好，基本可以在全葉面任一部位取樣；直接撕皮法和撕皮-刮去法取樣能力和定位性差，取樣面積也相對較小。

表1　不同下表皮獲取方法的制片結果比較

注：“-”表示無殘物；“+”表示有少量殘物；“++”表示有較多殘物；“+++”表示有大量殘物。

Note：“-”:no residue; “+”:few residue; “++”:more residue; “+++”:a lot of residue.

注：A.直接撕皮法；B.撕皮刮去法；C.煮沸撕取法；D.NaOH離析法；E.H2O2-HAC離析法。Note：A. Direct tearing method; B. Tearing-scraping method; C. Boiling tearing method; D. NaOH isolation method; E. H2O2-HAC isolation method.圖1　不同方法獲得的牡丹葉下表皮壓片的觀察(400×)Fig.1　Observation of Paeonia suffruticosaeaf lower epidermis with different methods(400×)

2.2不同染色劑對制片效果的影響從圖2可以看出，0.5%I-KI染液染色效果最好，可以清楚看到表皮細胞的形態、氣孔器的結構和保衛細胞內部分內含物質，細胞界線清晰，制片清晰程度高。0.5%番紅染液處理氣孔器的結構和表皮細胞也能看出，但染色的均勻度不好。1%番紅染液的染色效果不理想，只能反映出氣孔器的大概輪廓及開閉狀態，表皮細胞形態模糊。

注：A.0.5%I-KI染液；B.0.5%番紅染液；C.1%番紅染液。Note：A. 0.5%I-KI staining; B. 0.5% A red dye;C. 1% A red dye.圖2　不同染色劑獲得的牡丹葉下表皮壓片觀察(400×)Fig.2　Observation of Paeonia suffruticosaeaf lower epidermis with different staining methods

2.3撕皮-刮去法和H2O2-HAC離析法的氣孔真實度比較從表2可以看出，撕皮-刮去法和H2O2-HAC離析法對2種牡丹進行試驗，所測得的氣孔器長軸、短軸及氣孔密度無顯著差異。從氣孔器長軸和短軸長度來看，H2O2-HAC離析法測定值比撕皮-刮去法的測定值偏大。通過氣孔器大小和氣孔密度的測定結果可以看出，2種方法獲得的葉表皮制片的真實性都較高。

表2　撕皮-刮去法和冰醋酸離析法的氣孔形態比較

3結論

通過對5種不同方法的比較，直接撕皮法和撕皮-刮去葉肉細胞法制取下表皮是隨機的，其取樣能力和定位性能較差，但制片清晰度較高，操作簡單、真實性強等優點，使用于葉脈少，葉肉與表皮易于分離的牡丹品種。煮沸撕取法、NaOH離析法和H2O2-HAC離析法3種方法而言，定位性能強，所需儀器設備少，但煮沸撕取法和NaOH離析法葉肉細胞殘留較多，影響試驗結果的觀察。H2O2-HAC離析法耗時較長，但不受材料的限制，且葉肉殘留少、真實性強，可以大批量處理試驗材料，此方法不僅可用于氣孔形態、開關狀態和分布狀況等定性指標測定，還可以進行氣孔形態學指標的定量研究。不同染色劑對制片的影響結果來看，0.5%I-KI染色效果最好，氣孔器和表皮細胞的形態清晰、界線明顯。因此，選擇有效、適應性廣的牡丹葉下表皮氣孔觀察方法，為進一步研究不同牡丹品種氣孔形態學和抗逆生理的研究具有重要的輔助作用。

參考文獻

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基金項目菏澤學院開放實驗室(植物生物學實驗室)項目；菏澤學院科研研究項目(XYJJKY-2，XY13KJ02)。

作者簡介方純嬌(1994- )，女，福建漳州人，本科生，專業：生物科學。*通訊作者，副教授，碩士，從事植物逆境生理研究。

收稿日期2016-03-29

中圖分類號S 601

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-041-02

Comparative Study on the Observation Method ofPaeoniasuffruticosaLeaf Stomata

FANG Chun-jiao, HAN Xue, SHI Dong-yan*et al

(Department of Life Sciences, Heze University, Heze, Shandong 274015)

Abstract[Objective] Five different methods of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermis slice-preparing and the observation of stomata were comparatively studied. [Method] The slice of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermises were prepared with the method of directly tearing leaf epidermis, tearing leaf epidermis-scrape off mesophyll cells, NaOH maceration, H2O2-HAC maceration and boiling-tearing leaf epidermis and the preparation index was compared and the best stain was screened. [Results] The treatment of tearing leaf epidermis-scrape off mesophyll cells and H2O2-HAC maceration was best in all of preparation methods, which was less residual mesophyll and highly facticity. In the dyeing treatment, the treatment of 0.5% I-KI showed the good efficiency. [Conclusion] The foundation for the future research on the micro-morphological characteristics of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermis of different varieties would be laid.

Key wordsPaeonia suffruticosa; Stoma; Observation method; Stomatal density