甘藍過量表達硝酸還原酶基因對硝酸鹽積累的影響

張正英，陳玉梁

( 1.甘肅省農業科學院，蘭州　730070；2.甘肅省農業科學院 生物技術研究所，蘭州　730070)

甘藍過量表達硝酸還原酶基因對硝酸鹽積累的影響

張正英1，陳玉梁2

( 1.甘肅省農業科學院，蘭州730070；2.甘肅省農業科學院 生物技術研究所，蘭州730070)

為探索過量表達硝酸還原酶基因對甘藍(BrassicaoleraceaL. var.capitataL.)硝酸鹽積累的影響，以‘中甘11號’下胚軸為外植體，采用根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導法將煙草硝酸還原酶基因(NR)導入甘藍，獲得13株卡那霉素抗性植株。PCR和Southern blot檢測證實，NR基因已經成功導入并整合到甘藍的基因組。4個轉基因株系硝酸鹽質量分數明顯低于非轉基因供體株系，降幅為13.9%～23.0%。說明：將重組硝酸還原酶基因導入甘藍且得到超量表達，創制低硝酸鹽育種材料的方法可行。

甘藍；農桿菌介導法；硝酸還原酶基因；硝酸鹽質量分數

甘藍(BrassicaoleraceaL. var.capitataL.)是人們喜食的蔬菜之一。以甘藍、花椰菜、娃娃菜等優勢蔬菜產品為主的 “高原夏菜” 已成為甘肅農業的亮點，銷往全國80多個大中城市[7]。甘藍存在硝酸鹽積累的品種特異性，是較易積累硝酸鹽的蔬菜品種之一[8-9]。近年來，因栽培中過度使用化學肥料、農藥造成蔬菜化肥農藥殘留問題突出，重茬栽培葉類蔬菜硝酸鹽危害尤為明顯[10-11]。都韶婷等[12]研究顯示，篩選低硝酸鹽積累的蔬菜品種是降低蔬菜硝酸鹽積累的一種可行措施。

甘藍轉基因研究已在抗蟲、抗旱、耐鹽及雄性不育等方面取得較好的進展，優化以農桿菌介導法為主的基因轉化體系，明確子葉、下胚軸等外植體及基因型在甘藍基因轉化中的作用，創造一些具有利用前景的新材料[13-16]。為探索過量表達硝酸還原酶基因對甘藍硝酸鹽積累的影響，本研究將硝酸還原酶基因轉入甘藍且得到超量表達，獲得低硝酸鹽質量分數的育種材料，為其他蔬菜的品質改良提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料甘藍品種‘中甘11號’由甘肅省農業科學院飛天種業股份公司提供。試驗在甘肅省農業科學院生物技術實驗室進行。

1.1.2菌株和載體供試根癌農桿菌菌株為LBA4404。植物重組質粒表達載體pBCSL16由中國農業大學植物生理生化國家重點實驗室肖興國博士提供，質粒中目標基因NR與選擇基因nptⅡ相連，由 CaMV35s啟動子驅動(圖1)。

1.1.3培養基MS培養基為基本培養基，固體YEP培養基為培養農桿菌所用培養基，液體MS培養基為菌液懸浮培養基。甘藍遺傳轉化培養基及其配方見表1。

圖1　植物表達載體pBCSL16結構

1.2試驗方法

1.2.1外植體準備將預冷處理的‘中甘11’號種子，用自來水沖洗30 min，40 ℃水浸泡30 min，濾去水分；用φ=75%乙醇處理1 min，再用1 g/L HgCl2消毒8 min，無菌水清洗6次；接種到播種培養基上發芽。取7 d齡苗的下胚軸接種于預培養培養基，25 ℃暗處預培養2 d，用于轉化試驗。

1.2.2侵染菌液制備挑取含有NR質粒的農桿菌LBA4404單菌落，接種于5 mL液體YEB培養基(含50 mg/L卡那霉素和100 mg/L鏈霉素)，28℃、250r/min振蕩培養過夜；將培養好的菌液按1%的接種量接種至YEB培養基(含50 mg/L卡那霉素和100 mg/L鏈霉素)，28 ℃繼續培養24 h，直到OD600約為1.0左右，將菌液懸浮液在8 000 r/min離心8 min收集菌體，用無菌的1/2 MS培養基重新懸浮菌體沉淀，并按照懸浮液和1/2 MS培養基按一定比例稀釋，使獲得的侵染菌液OD600值約為0.6。

表1　甘藍遺傳轉化培養基

1.2.3遺傳轉化取出在預培養培養基上暗培養2 d的下胚軸，浸入用1/2 MS稀釋、OD600值為 0.6的工程菌液，浸染10 min，期間一直輕微搖動，使農桿菌與外植體充分接觸；用濾紙吸去外植體表面過多的菌液，接種于置有一層無菌濾紙的MS培養基，每皿接種10～15個外植體，25 ℃黑暗共培養2 d。清洗外植體，轉入加有500 mg/L羧芐青霉素的分化培養基，25 ℃、16 h/8 h光周期下培養，誘導抗性愈傷組織產生。采用延遲篩選法篩選抗性芽，即在得到綠色分化芽時轉入加有卡那霉素的延遲選擇培養基，且卡那霉素質量濃度由5 mg/L逐漸增加到20 mg/L。經卡那霉素篩選至抗性芽長1 cm左右，將保持綠色的抗性芽轉入生根培養基中長成完整綠色植株。未用農桿菌侵染的對照外植體用同樣方法進行培養。對篩選得到的生根綠苗進行編號，通過莖段進行擴繁，擴大株系群體。將經分子鑒定、生根健壯的轉化苗開瓶練苗7 d，沖洗干凈根部的培養基，移入V(蛭石)∶V(土)=1∶1的花盆，開始用塑料薄膜覆蓋花盆，并及時澆水、通風，后期管理同溫室培養常規管理。按獲得的抗性植株占總外植體的百分率統計轉化率。

1.2.4PCR分子檢測分別取經抗生素篩選的T0遺傳轉化再生植株葉片和對照植株葉片各2 g，用CTAB法[17]提取甘藍基因組DNA。根據nptⅡ基因序列設計引物，預期擴增片段大小為676 bp。上、下游引物序列分別為：5′-CGTAAAGCACGAGGAAGC-3′和5′-AATGAACTCCAGGACGAGG-3′，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L dNTP 2.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，20 μmol/L兩端引物各1.0 μL，TaqDNA 聚合酶1 U，基因組DNA 模板200 ng，加雙蒸水至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，68 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。取樣10.0 μL經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

1.2.5Southern blot雜交分析以提取的轉化植株基因組DNA為樣品，以質粒pBCSL16經BamHⅠ酶切 DNA為正對照，以非轉化植株基因組DNA為負對照，DNA經內切酶BamHⅠ消化，8 g/L瓊脂糖電泳檢測酶切結果準確后，采用毛細管轉移法轉至硝酸纖維素膜，準備分子雜交。質粒用BamHⅠ酶切，回收約3.7 kb的硝酸還原酶基因片段作模板，用地高辛標記該片段作為雜交探針，進行Southern blot雜交。探針標記、雜交及檢測試劑盒為DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ，購自羅氏診斷產品(上海)有限公司，具體步驟按照試劑盒操作說明執行。

1.2.6轉基因株系硝酸鹽質量分數測定轉基因和對照植株在溫室生長約 2個月后，取其葉片采樣。每個株系測定4株，以未轉化植株為對照，測定方法采用GB/T 15401-1994。

2結果與分析

2.1甘藍轉化體系的建立及轉化植株的獲得

在對影響轉化效果的關鍵因素進行優化后，初步建立一套適宜‘中甘11號’的遺傳轉化體系，即將7 d苗齡的下胚軸，在預培養基中培養2 d后作為外植體，在OD600約 0.6的農桿菌工程菌液中浸染10 min，再在pH為5.8、不加抗生素的分化培養基中共培養2 d；經愈傷組織誘導分化、繼代培養與抗生素延遲篩選、生根生長等過程，獲得抗性工程植株13株，遺傳轉化頻率為10.9%。

2.2轉化植株的 PCR檢測與Southern blot雜交

以質粒pBCSL16為陽性對照，未轉化基因植株為陰性對照，對13株抗性苗中生長健壯的4株進行 PCR分析。4株轉基因植株均得到 1條676 bp的片段，與預期片段大小相符(圖2)。

將 PCR檢測為陽性的 4株轉基因植株進行Southern blot雜交分析，4株植株均獲得明顯的雜交信號，而非轉化對照基因組中未出現任何雜交信號，進而證實NR基因已整合至甘藍基因組(圖3)。

1. Marker；2. 陽性對照Positive control；3. 陰性對照Negative control；4～7. 轉化植株G2、G4、G6、G21Transgenic plants: G2,G4,G6 and G21

圖2甘藍轉化植株的PCR 鑒定

Fig.2PCR amplification of transgenic plants of cabbage

1. Marker；2. 陰性對照Negative control；3. 陽性對照Positive control；4～7. 轉化植株G2、G4、G6、G21Transgenic plants: G2,G4,G6 and G21

圖3甘藍轉化植株的 Southern blot雜交

Fig.3Southern blot hybridization of

transgenic cabbage plants

2.3甘藍轉基因植株硝酸鹽質量分數

對轉基因甘藍植株葉片硝酸鹽質量分數進行測定，結果顯示，甘藍轉基因植株體內硝酸鹽質量分數均顯著低于未轉基因對照株，降低13.9%～23.0%，其中，株系G2和G21降低幅度最大，接近和達到23.0%(圖4)。說明，利用基因工程技術降低蔬菜植株硝酸鹽質量分數的方法可行。

圖4　轉基因甘藍植株硝酸鹽質量分數

3結論與討論

因為氮肥用量增加及連作，蔬菜中累積硝態氮的增加程度遠大于生長量的增加量[8]，這是蔬菜中硝酸鹽質量分數較高的起因。提高氮素肥料利用率、降低硝酸鹽積累量、提高硝酸還原酶活性是降低蔬菜中硝酸鹽質量分數的有效途徑，本研究初步證明，與甘藍未轉基因對照株比較，轉基因植株體內的硝酸鹽質量分數降低13.9%～23.0%，差異十分明顯，說明：通過基因的過量表達可以實現降低蔬菜中硝酸鹽含量的目標。

建立高效的遺傳轉化體系是實現轉基因遺傳操作的基礎。有研究顯示，建立較好的種子表面消毒技術，平均發芽率可達到75%以上[18]。以無菌苗子葉、下胚軸為外植體，從基因型、苗齡、培養基(生長調節劑、AgNO3質量濃度等)等因素研究甘藍轉化體系，發現用下胚軸作外植體效果明顯優于子葉。王肖紅等[19]、李春雨等[16]、何紹敏等[20]等以甘藍下胚軸為外植體成功獲得耐鹽、不育和抑制自交不親和的轉化體。

在甘藍類蔬菜上，多數試驗采用10～25 mg/L卡那霉素作為篩選壓[21]。預備試驗發現，較低質量濃度(5 mg/L)的卡那霉素可抑制下胚軸再生，當卡那霉素質量濃度高于20 mg/L可致甘藍不定芽白化死亡，說明甘藍對卡那霉素非常敏感，為達到既不影響再生又確保篩選的目的，采取抗生素延遲篩選的辦法效果較好。即在分化初期的培養基中(第1周)不加卡那霉素，僅加入羧芐青霉素，抑制農桿菌；待外植體膨大產生愈傷后，繼代篩選培養過程中加入卡那霉素，選擇壓力由5 mg/L逐漸增加到20 mg/L進行抗性篩選。加入卡那霉素后外植體的分化速度減緩，部分外植體開始白化或褐化死亡，每隔15 d進行繼代培養，隨著選擇次數的增加逐漸降低羧芐青霉素質量濃度至200 mg/L，直至分化出綠苗。

在農桿菌介導的蕓苔屬蔬菜遺傳轉化方法中，轉化效率受基因型和外植體影響較明顯。甘藍轉基因的難度較大，品種間也存在較大差異[22]。

本研究僅建立甘藍品種‘中甘11號’的遺傳轉化體系，而且不是純系自交系，限制獲得材料的應用；由于外源基因的插入位點具有隨機性，目標基因在后代中的遺傳穩定性和表達還有待于深入研究。

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Effect of Overexpression of Nitrate Reductase Gene on Nitrate Accumulation in Cabbage

ZHANG Zhengying1and CHEN Yuliang2

(1. Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730070,China;2.Institute of Biotechnology,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730070,China)

To explore the effects of overexpression of nitrate reductase gene on cabbage(BrassicaoleraceaL. var.capitataL.) nitrate accumulation,the nitrate reductase gene from tobacco was transfer into genome of cabbage cultivar ‘Zhonggan No.11’ viaAgrobacteriumtumefaciensand 13 transgenic plants with kanamycin risistance were obtained.PCR and Southern blot showed that nitrate reductase gene was successfully integrated into the genome of cabbage. Determination of leaf nitrate content showed that nitrate content were significantly lower,with the decline range of 13.9%-23.0%,in four transgenic lines than the donor line. The results indicated that it is feasible to create cabbage breeding materials characterized low nitrate by means of excessively expressing the restructured nitrate reductase genes.

Cabbage;Agrobacterium-mediated gene transfer; Nitrate reductase gene; Nitrate mass fraction

2016-02-23

2016-04-20

The National Natural Science Foundation of China(No.31460350); the Operating Sci-tech Project of Gansu province(No.QS022-C31-048).

ZHANG Zhengying,male,associate research fellow.Research area:genetics and breeding in crops.E-mail:kegc8@sina.com

(責任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

2016-02-23修回日期：2016-04-20

國家自然科學基金(31460350)；甘肅省科學事業費(QS022-C31-048)。

張正英，男，副研究員，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：kegc8@sina.com

S335.3

A

1004-1389(2016)07-1024-05

網絡出版日期：2016-06-30

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1624.018.html