‘中華獼猴桃’根皮提取物抗煙草花葉病毒活性測定

魏志平，沈　靜，周　玉，張秀云

(西北農林科技大學 無公害農藥研究服務中心，陜西楊凌　712100)

‘中華獼猴桃’根皮提取物抗煙草花葉病毒活性測定

魏志平，沈靜，周玉，張秀云

(西北農林科技大學 無公害農藥研究服務中心，陜西楊凌712100)

為開發出對環境友好的植物源抗病毒劑，以煙草花葉病毒(TMV)為供試病毒，采用半葉枯斑法測定‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物和不同極性萃取物的抗病毒活性。結果顯示， 10 g/L‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物(乙醇體積分數為95%)對TMV體外鈍化、抑制初浸染及抑制增殖的活性分別為83.55%、49.51%和48.44%；不同極性溶劑萃取物的活性也存在差異，其中，水相的活性較強，對TMV的體外鈍化、抑制初浸染及抑制增殖的活性分別為97.49%、54.11%和64.01%，其次是正丁醇萃取物，分別為 56.64%、27.32%和57.76%。

中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch)；煙草花葉病毒；體外鈍化活性；抑制初浸染活性；抑制增殖活性

煙草花葉病毒病是一種重要的病害。在煙草生產中，煙草花葉病毒廣泛分布于中國各煙草種植區[1]。煙草花葉病毒病不僅影響煙葉產量和外觀品質，也使上等煙草比例下降，造成巨大的經濟損失。因此，煙草花葉病毒病已經成為當前制約中國高品質煙葉生產的重要因素[2]。

‘中華獼猴桃’是獼猴桃屬的一種，是中國特有的品種，主要分布于中國陜西、江西、湖南、湖北、福建、浙江、安徽等省[3]。獼猴桃全株有藥用作用，中醫認為，其根皮冷，味道苦澀，活血消腫，驅逐風和濕、利尿、止血、功效熱，可治療肝炎、類風濕性關節炎、痢疾、絲蟲病、胃癌、乳腺癌等疾病[4]?，F代藥理研究發現，獼猴桃的根皮可有效清除活性氧自由基，有防病毒、護肝臟、抑制腫瘤細胞生長、增強免疫力等功效。近年來，作為傳統中藥，對獼猴桃根皮在醫藥方面作用有很多研究，但在農業應用方面研究較少。陳靠山等[5]研究發現，獼猴桃根皮提取物對小菜蛾、菜青蟲、蚜蟲均有較強的忌避、觸殺和胃毒作用。

與有機合成農藥相比，植物源農藥有選擇性高、毒性低、易降解、不容易產生耐藥性等特點[6]，尤其在抗植物病毒方面效果明顯。目前，紫莖澤蘭、商陸、臭椿等植物粗提物均已被證實具有較強的抗植物病毒活性[7-8]。近年來，西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心在篩選具有抗植物病毒活性的資源時發現，‘中華獼猴桃’根皮具有較強的抗植物病毒活性。因此，本研究對‘中華獼猴桃’根皮的粗提取物進行初步分離，分別測定不同極性萃取段的活性，以期進一步確定獼猴桃根皮的抗病毒活性成分，明確活性化合物的結構和性質，為開發新型植物源農藥奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試病毒與植物

‘中華獼猴桃’根皮采自秦嶺，經鑒定后在陰涼處自然風干，小型植物粉碎機粉碎，過50目篩。供試病毒為煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)普通株系，由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心保存；供試TMV局部枯斑寄主為心葉煙，TMV系統侵染寄主為普通煙(Nicotianatabacum)‘K326’品系，均在防蟲網溫室培育。

1.2‘中華獼猴桃’根皮提取物的制備

稱取獼猴桃根皮干粉，用φ=95%的乙醇浸泡提取3次，合并3次提取液，旋轉蒸發儀減壓濃縮至膏狀，得到乙醇提取物，留少量浸膏備用；將乙醇提取物用水捏溶，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次各萃取3次，合并萃取液，旋轉蒸發儀減壓濃縮至膏狀，分別得到各萃取段浸膏及水相浸膏。分別稱取不同萃取物的浸膏適量，配制成10 g/L的提取物溶液，備用。

1.3抗病毒生物活性測定

1.3.1對TMV體外鈍化作用采用半葉枯斑法[9]。選取健康、葉片大小一致、4～6葉期的枯斑寄主，TMV的枯斑寄主為心葉煙。將10 g/L提取物溶液與20 mg/L病毒汁液等體積混合后，鈍化10 min，立即用食指沿葉脈方向輕輕摩擦接種于心葉煙左半葉，以右半葉接種病毒液與PBS水的等體積混合液作為對照。每株接種5片葉，每次處理3株。3 d后統計枯斑數量，計算抑制率。

抑制率=(對照平均枯斑數-處理平均枯斑數)/對照平均枯斑數×100%。

1.3.2抑制初侵染(預防)活性測定采用半葉枯斑法。選取健康、葉片大小一致、4～6葉期的煙苗作為寄主，沿葉脈方向將供試藥劑涂抹于枯斑寄主的左半葉，右半葉涂抹PBS水溶液。24 h后分別用病毒汁液摩擦接種于整個葉片，病毒接種質量濃度為20 mg/L。每株接種5片葉，每次處理3株，3 d后統計枯斑數，按照 “1.3.1” 中抑制率計算公式計算抑制率。

1.3.3抑制增殖(治療)活性測定采用半葉枯斑法。選取健康、葉片大小一致、4～6葉期的煙苗作為寄主，然后用食指沿葉脈方向輕輕摩擦病毒汁液接種于整個葉片，病毒接種質量濃度為20 mg/L。24 h后將供試藥劑涂抹在枯斑寄主左半葉，右半葉用蒸餾水處理，每株接種5片葉，每次處理3株，3 d后統計枯斑數，按 “1.3.1” 抑制率計算公式計算抑制率。

2結果與分析

2.1體外鈍化活性分析

‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物及各萃取物對TMV體外鈍化活性見表1。由表1可知，乙醇提取物及不同溶劑萃取物對TMV均有一定的鈍化活性，其中，水相對枯斑抑制率最高，達97.49%，其次為乙醇提取物，為83.55%，而石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取物的枯斑抑制率均低于60%。說明，‘中華獼猴桃’根皮中對TMV體外鈍化活性的分子多為水溶性成分。

表1　‘中華獼猴桃’根皮提取物不同萃取段對TMV的體外鈍化活性

注：數據均為3次重復平均值，同列數據后不同字母表示經Duncan’s新復極差法檢驗差異顯著(P<0.05)。提取液質量濃度為10 g/L，下表同。

Note:Data are the means of 3 replicates, data with different letters in the same column are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. The mass concentrations of extract for test were 10 g/L,the same as below.

2.2抑制初侵染(預防)活性分析

‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物及各段萃取物對TMV的預防活性見表2。提前24 h用‘中華獼猴桃’根皮提取物及不同溶劑萃取物處理心葉煙，結果顯示，乙醇提取物和正丁醇萃取物、水相均對心葉煙有較好的預防活性。其中，乙醇提取物對枯斑抑制率為49.51%，水相的活性稍有提高，為 54.11%，其他3種溶劑萃取物對枯斑抑制率均較低。由此可以看出，‘中華獼猴桃’根皮中抑制TMV初侵染活性的分子存在于極性較大的水相。

表2　‘中華獼猴桃’根皮提取物不同萃取段對TMV的抑制初侵染活性(預防)

2.3抑制增殖(治療)活性分析

‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物及各段萃取物對TMV的治療活性見表3。由表3可知，提前24 h對心葉煙接種病毒后，用‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物及不同溶劑萃取物進行處理，水相和正丁醇萃取物相的抑制率分別達到64.01%和57.76%，乙醇提取物對TMV抑制增殖率達48.44%。石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物抑制率很低，說明‘中華獼猴桃’根皮對TMV的抑制增殖活性部位在正丁醇和水相部分。

表3　‘中華獼猴桃’根皮不同萃取段對TMV抑制增殖(治療)

注：“-”表示沒有作用。

Note:“-”means no effect.

3討 論

從天然產物尤其從植物中獲得農用活性成分是當前抗病毒劑的研究熱點。植物中活性成分具有與環境友好、對人和動物低毒等優點。獼猴桃根皮作為傳統中藥，具有活血消腫、清熱利尿、祛風利濕、散熱止血的功效?，F代藥理學研究表明，‘中華獼猴桃’具有抗腫瘤、抗突變、抗病毒、降血脂、保肝、提高免疫力等多種藥理活性[10-11]，具有廣泛的開發前景，但獼猴桃根皮在農業上應用較少。有文獻報道，獼猴桃具有一定的抑菌活性，并從‘中華獼猴桃’分離得到三萜類、黃酮類、甾醇類、糖類、有機酸等一系列活性化合物[12-14]。篩選具有農用活性的植物提取物時發現，‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物具有較強的抗煙草花葉病毒活性。進一步活性測試發現，‘中華獼猴桃’根皮乙醇提取物經不同極性溶劑萃取后，其抗病毒活性表現不同，總體來說，水相和正丁醇萃取物的活性較強，而石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物的活性較弱，甚至不表現抗病毒活性。水相在鈍化、預防、治療方面都顯示出較好的活性，由此推測，‘中華獼猴桃’根皮提取物中的抗病毒活性成分可能是極性較強的糖苷類，也可能是多糖或者糖蛋白等高分子化合物[15-18]，這為下一步進行活性成分分離提供了思路和依據。

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Anti-TMV Activity of the Extract ofActinidiachinensisPlanch. Root Bark

WEI Zhiping, SHEN Jing, ZHOU Yu and ZHANG Xiuyun

(Research and Development Center of Biorational Pesticide, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

In order to develop environmentally friendly source of plant anti-virus pesticide,the antiviral activities of the extract ofActinidiachinensisPlanch. root bark against tobacco mosaic virus (TMV) were tested by half leaf method.The results showed thatφ=95% Ethanol extract ofActinidiachinensisPlanch. root bark showed anti-TMV activities to some extent, with the inactivating, inhibiting infectivity and inhibiting multiplication activities of 83.55%,49.51% and 48.44% under the concentration of 10 g/L. Extracts with different polar solvents possessed diverse activities. The strongest activities appeared in water extract, with the inactivating, inhibiting infectivity and inhibiting multiplication activities of 97.49%, 54.11% and 64.01%, followed by n-Butanol phase, with the activities of 56.64%,27.32% and 57.76%. It is suggested that the anti-TMV compounds should be hydrosoluble.

ActinidiachinensisPlanch.; Tobacco mosaic virus (TMV); Inactivating activities; Inhibiting infectivity activities; Inhibiting multiplication activities

2015-12-07

2016-01-19

The Special Fund for Basic Scientific Research of Central University (Northwest A&F University).

WEI Zhiping, male, master student. Research area:pesticide chemistry. E-mail:18792763808@163.com

ZHANG Xiuyun, female, Ph.D,lecturer, master supervisor. Research area:pesticide chemistry. E-mail:zhangxiuyun@nwsuaf.edu.cn

(責任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

2015-12-07修回日期：2016-01-19

中央高校基本科研業務專項基金。

魏志平，男，碩士研究生，研究方向為農藥化學。E-mail:18792763808@163.com

張秀云，女，博士，講師，碩士生導師，研究方向為農藥化學。E-mail:zhangxiuyun@nwsuaf.edu.cn

S482.1

A

1004-1389(2016)07-1087-05

網絡出版日期：2016-06-30

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1643.048.html