大孔吸附樹脂-聚酰胺聯用純化茅巖莓總黃酮工藝優化

金慧鳴，郭紅英，譚興和*，劉夢浩，王 鋒，蔡 文，張 喻，鄧潔紅（湖南農業大學食品科技學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙　410128）

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大孔吸附樹脂-聚酰胺聯用純化茅巖莓總黃酮工藝優化

金慧鳴，郭紅英，譚興和*，劉夢浩，王 鋒，蔡 文，張 喻，鄧潔紅
（湖南農業大學食品科技學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙410128）

摘 要：為純化茅巖莓總黃酮，先用HPD-100型大孔吸附樹脂（macroporous adsorption resin，MAR）層析柱進行初步純化，再用聚酰胺（polyamide，PA）層析柱進行第2次純化，得到的HPD-100型MAR最適宜吸附工藝參數為上樣液總黃酮質量濃度6 mg/mL、上樣流速1 mL/min、上樣液體積130 mL，在此條件下吸附率為97.14%；最適宜解吸工藝參數為洗脫液乙醇體積分數70%、洗脫流速1 mL/min、洗脫液體積40 mL，在此條件下解吸率為94.10%。經HPD-100型MAR純化后的總黃酮純度從55.00%提高到了72.25%。PA的最適宜吸附工藝參數為上樣液總黃酮質量濃度6 mg/mL、上樣流速2 mL/min，在此條件下吸附率為99.57%；最適宜解吸工藝參數為洗脫液乙醇體積分數70%、洗脫流速1 mL/min、洗脫液體積55 mL，在此條件下解吸率為76.50%。經PA純化后總黃酮純度從72.25%提高到了80.75%。該方法為茅巖莓黃酮的純化提供了一種更高效的方法，具有良好的應用前景。

關鍵詞：茅巖莓；總黃酮；大孔吸附樹脂；聚酰胺；純化

引文格式：

金慧鳴, 郭紅英, 譚興和, 等. 大孔吸附樹脂-聚酰胺聯用純化茅巖莓總黃酮[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 13-18.

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茅巖莓，學名顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），系葡萄科蛇葡萄屬的一種野生藤本植物，其干燥的葉片黃酮類化合物含量極高，最高可達干質量的45%左右，具有抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、保肝護肝的功效[1-4]。其中，總黃酮中含量最高的是二氫楊梅素，最新研究證明其具有抑制乳腺癌細胞和前列腺癌細胞增殖的作用[5-7]。隨著人們對黃酮保健作用認識的加強，茅巖莓黃酮的利用越來越得到重視。

近年來，大孔吸附樹脂（macroporous adsorption resin，MAR）被廣泛用于化學和醫藥行業中，尤其是植物粗提物中生物活性物質的提取純化分離，它具有操作成本低、溶劑耗費少、工作強度小、容易再生等優點[8-11]。聚酰胺（polyamide，PA）是一種以酰胺鍵聚合形成的高分子化合物，主要通過氫鍵之間相互作用的親和力進行吸附[12-13]，其對黃酮化合物有很強的吸附性能，且分離和脫色效果好，可以彌補MAR的一些不足。本研究試圖通過MAR與PA聯用，確定純化茅巖莓總黃酮的工藝參數，旨在為茅巖莓總黃酮的純化提供一種更高效的方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

干茅巖莓葉（用中藥粉碎機將其粉碎，過120 目篩，裝入密封袋備用）張家界茅巖莓公司；二氫楊梅素標準品（色譜級，純度≥99%）成都曼思特生物科技有限公司；HPD-100型MAR鄭州勤實科技有限公司；PA粉（80～100 目）、無水乙醇（分析純）、三氯化鋁（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）天津市風船化學試劑科技有限公司；鹽酸（分析純）衡陽市凱倍化工試劑有限公司。

1.2儀器與設備

FW177中草藥粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-250DE超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發器、SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵鞏義市予華儀器有限公司；FD-1B真空冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司；SKY-200B氣浴搖床上海蘇坤實業有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度儀、ATX224電子分析天平日本島津公司；DENVER電子天平北京賽多利斯儀器有限公司；100、1 000、5 000 μL移液槍艾本德（中國）有限公司。

1.3方法

1.3.1茅巖莓黃酮含量的測定

采用紫外分光光度法[14]并做適當改進。精密稱取1.8 mg二氫楊梅素標準品于10 mL容量瓶里，用95%乙醇溶液定容；再從中準確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于25 mL容量瓶中，分別加入3 mL質量分數5%的AlCl3溶液，用95%乙醇溶液定容到刻度，搖勻，配制成質量濃度分別為0、0.002 88、0.005 76、0.008 64、0.011 52、0.014 40、0.017 28 mg/mL的二氫楊梅素標準溶液，在室溫放置40 min，于紫外分光光度計296 nm波長處測定吸光度。以二氫楊梅素質量濃度C為橫坐標、吸光度A為縱坐標繪制茅巖莓總黃酮標準曲線，并通過線性回歸得到回歸方程：A=48.090 3C－0.000 8，R2=0.999 8。

1.3.2MAR的預處理

按照文獻[15]進行預處理，處理完后置于蒸餾水中備用。

1.3.3PA的預處理

按照文獻[16]進行預處理，處理完后置于蒸餾水中備用。

1.3.4MAR上樣液的制備

上樣液制備流程：茅巖莓粉→加入乙醇溶液→超聲波輔助乙醇法提取→過濾→旋轉蒸發成浸膏狀→冷凍干燥→加蒸餾水配制成不同質量濃度總黃酮溶液（超聲波助溶）→備用。

提取條件為：乙醇體積分數67%、超聲波處理溫度58 ℃、超聲波處理時間28 min、液料比22.5∶1（mL/g）[17]。

1.3.5MAR動態吸附與解吸工藝參數的確定

取2 0 m L已處理好的M A R濕法裝入層析柱（Φ18 mm×300 mm）中，再將茅巖莓總黃酮溶液上柱，待總黃酮溶液通過樹脂柱后，用大約4～5 BV （1 BV=20 mL）蒸餾水沖洗樹脂柱，最后用乙醇溶液進行洗脫。通過測定吸附液和洗脫液中總黃酮質量濃度并計算吸附率和解吸率，考察上樣液總黃酮質量濃度、上樣流速、上樣液體積以及洗脫液體積分數、洗脫流速、洗脫液體積對MAR性能的影響，確定最適宜工藝參數。

1.3.6PA動態吸附與解吸工藝參數的確定

取經MAR最適宜工藝參數吸附和洗脫處理的總黃酮溶液，測得洗脫液中總黃酮的質量，通過旋轉蒸發儀去除有機溶劑，再加入水溶液配制成不同總黃酮質量濃度的溶液作為上樣液，備用。量取20 mL已處理好的PA濕法裝入層析柱（Φ18 mm×300 mm）中，將上樣液通過PA柱進行吸附，考察上樣液總黃酮質量濃度和上樣流速對PA性能的影響，再用4～5 BV蒸餾水沖洗，然后分別用體積分數為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液以1 mL/min進行洗脫，每流出5 mL流出液收集并測定總黃酮質量濃度，并以洗脫液體積為橫坐標、流出液中總黃酮質量濃度為縱坐標繪制動態洗脫曲線，從而確定最適宜的洗脫液體積和乙醇體積分數。最后考察不同洗脫流速對PA性能的影響。

1.3.7吸附率和解吸率的計算

通過測定上樣液、吸附液和洗脫液中總黃酮的質量濃度來計算吸附率和解吸率，如式（1）、（2）所示：

式中：C0為上樣液總黃酮質量濃度/（mg/mL）；C1為吸附液總黃酮質量濃度/（mg/mL）；C2為洗脫液總黃酮質量濃度/（mg/mL）；V1為上樣液體積/mL；V2為洗脫液體積/mL。

1.3.8總黃酮純度的測定

分別將MAR和PA的洗脫液置于旋轉蒸發儀中濃縮成浸膏狀，再冷凍干燥成粉末。準確稱取適量總黃酮粉，用95%乙醇溶液溶解，用1.3.1節方法測定溶液中總黃酮質量濃度，從而計算樣品中黃酮純度，如式（3）所示：

式中：C為溶液中總黃酮質量濃度/（mg/mL）；V為溶解總黃酮粉所用的乙醇溶液體積/mL；m為稱取的總黃酮粉質量/g。

2　結果與分析

2.1MAR動態吸附與解吸工藝參數的確定

2.1.1上樣液總黃酮質量濃度對吸附效果的影響

一是著力加強供應環節管理。建立科學有效的比價采購機制，力求質優價廉；建立農資品質監控體系，對采購農用物資的名稱、產地、商標、數量等進行驗證，并委托相關部門檢驗合格后，方可大面積使用；加強采購合同管理和大隊庫存農資的管理。

分別取50 mL總黃酮質量濃度為2、4、6、8 mg/mL的上樣液，以上樣流速1 mL/min通過已處理好的MAR，收集吸附后的流出液，測定其總黃酮質量濃度并計算吸附率。

圖1　上樣液總黃酮質量濃度對吸附效果的影響Fig. 1　Effect of total flavonoids concentration in sample on the adsorption efficiency

由圖1可知，上樣液總黃酮質量濃度較小時吸附率也較低，2～6 mg/mL范圍內，吸附率隨著質量濃度的增加而增加，上樣液總黃酮質量濃度為6 mg/mL時，吸附率達到最大，繼而又隨著質量濃度的增加而降低。這是由于上樣液總黃酮質量濃度越高，單位表面積內的總黃酮與MAR接觸量越多，吸附量也就越多大[18]。但如果上樣質量濃度太大，可能不僅使總黃酮在樹脂中擴散能力下降，而且與總黃酮競爭吸附的雜質量也隨之增大[19]，MAR更容易達到飽和，使得總黃酮得不到充分吸附，易造成能源浪費。所以，最適宜的上樣液總黃酮質量濃度為6 mg/mL。

2.1.2上樣流速對吸附效果的影響

取50 mL總黃酮質量濃度為6 mg/mL的上樣液分別以上樣流速0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min通過已處理好的MAR柱，收集吸附后的流出液，測定其總黃酮質量濃度并計算吸附率。

圖2　上樣流速對吸附效果的影響Fig. 2　Effect of sample flow rate on the adsorption efficiency

由圖2可知，吸附率隨著上樣流速的增加而逐漸下降，但下降趨勢較緩慢。因為上樣液流速過快，目標物來不及被樹脂充分吸附就會開始泄漏；而上樣流速過慢，目標物與樹脂接觸越充分，從而提高MAR的吸附量，但會降低吸附效率[19-20]，因此在不影響吸附效率的情況下選擇合適的上樣流速非常重要。綜合考慮吸附效果與工作效率兩個因素，選擇1 mL/min為最適宜的上樣流速。

2.1.3上樣液體積對吸附效果的影響

取150 mL總黃酮質量濃度為6 mg/mL的上樣液分別以上樣流速1 mL/min通過 已處理好的MAR柱，以5 mL為一個體積單位收集流出液，測定其總黃酮質量濃度，并以上樣液體積為橫坐標、流出液總黃酮質量濃度為縱坐標繪制動態吸附曲線，考察上樣液體積對吸附效果的影響。

圖3　動態吸附曲線Fig. 3　Dynamic adsorption curve

從圖3可以看出，上樣液體積0～125 mL時，流出液總黃酮質量濃度很低，且基本處于穩定平緩的趨勢；當上樣液體積繼續增加到130 mL時，質量濃度開始明顯上升；當上樣液體積達到135 mL時，流出液總黃酮質量濃度為0.911 mg/mL，已經超過上樣液總黃酮質量濃度的1/10，故視130 mL為泄漏點[16]。因此，確定上樣液體積為130 mL，經計算吸附率達97.14%。

取130 mL總黃酮質量濃度為6 mg/mL的上樣液以上樣流速1 mL/min通過已處理好的MAR柱，再用4～5 BV蒸餾水以1 mL/min的流速沖洗MAR柱使流出液為無色透明。分別用50 mL體積分數為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液作為洗脫液在1 mL/min的流速條件下進行洗脫，收集洗脫液，測定其總黃酮質量濃度并計算解吸率。

圖4　洗脫液體積分數對解吸效果的影響Fig. 4　Effect of eluent concentration on the desorption efficiency

考慮茅巖莓黃酮基本用于食品及醫藥領域，因此選擇相對安全性較高的乙醇作為洗脫液。由圖4可知，乙醇體積分數30%～70%，解吸率隨著乙醇體積分數的增大而增大；乙醇體積分數為70%時，解吸率最高；之后再增加乙醇體積分數，解吸率又隨之降低。這是因為乙醇體積分數不同，極性大小也不同，而黃酮與MAR之間存在著一定的范德華力，兩物質的極性越相近則范德華力越大[21]。可能由于70%乙醇溶液與茅巖莓黃酮的極性更為接近，因此最容易被洗脫下來，故選擇70%為最適宜的洗脫液乙醇體積分數。

2.1.5洗脫流速對解吸效果的影響

圖5　洗脫流速對解吸效果的影響Fig. 5　Effect of elution velocity on the desorption efficiency

取130 mL總黃酮質量濃度為6 mg/mL的上樣液，以上樣流速1 mL/min通過已處理好的MAR柱，再用4～5 BV蒸餾水以1 mL/min的流速沖洗MAR柱使流出液為無色透明。用50 mL 70%乙醇溶液作為洗脫劑分別在0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的流速 條件下進行洗脫，收集洗脫液，測定其總黃酮質量濃度并計算解吸率。

由圖5可知，當洗脫流速為0.5～1 mL/min時，解吸率隨著洗脫流速的增加而逐漸增加；流速為1 mL/min時，解吸率達到最高；之后解吸率又隨著流速進一步增加而逐漸降低，這可能是因為流速過快縮短了MAR表面活性部位與總黃酮相互作用的時間[22]。因此，洗脫流速以1 mL/min為宜。

2.1.6洗脫液體積對解吸效果的影響

取130 mL總黃酮質量濃度為6 mg/mL的上樣液，以上樣流速1 mL/min通過已處理好的MAR柱，再用4～5 BV蒸餾水以1 mL/min的流速沖洗MAR柱使流出液為無色透明。用50 mL 70%乙醇溶液作為洗脫劑在1 mL/min的流速條件下進行洗脫，以5 mL為一個體積單位收集流出液，測定其總黃酮質量濃度，并以洗脫液體積為橫坐標、流出液總黃酮質量濃度為縱坐標繪制動態洗脫曲線，考察洗脫液體積對解吸效果的影響。

圖6　動態洗脫曲線Fig. 6　Dynamic desorption curve

由圖6可知，當洗脫液體積為5 mL時，流出液中總黃酮質量濃度相對較小，隨后急劇上升，洗脫液體積為15 mL時，總黃酮質量濃度達到最大值，為65.465 mg/mL；當洗脫液體積達到45 mL時，總黃酮質量濃度只有0.052 mg/mL。因此，選擇40 mL為最適宜的洗脫液體積，此時，解吸率為94.10%。從該洗脫曲線可以看出，40 mL的洗脫液可以把茅巖莓總黃酮基本洗脫完全，且峰形較對稱，無拖尾。

2.2PA動態吸附與解吸工藝參數的確定

2.2.1上樣液總黃酮質量濃度對吸附效果的影響

分別將已去除有機溶劑的MAR解吸液（總黃酮含量為702 mg）加入一定量水溶液配制成總黃酮質量濃度為3、4、5、6 mg/mL的溶液，以上樣流速1 mL/min通過已處理好的PA柱，收集吸附后的流出液，測定其總黃酮質量濃度并計算吸附率。

由圖7可知，上樣液總黃酮質量濃度在3、4、5、6 mg/mL時，吸附率分別為99.57%、99.71%、99.59%、99.87%，差別非常小，均在99%以上。說明在此范圍內，總黃酮質量濃度對吸附效果影響非常小，且吸附效果非常好。因上樣液總黃酮質量已固定，考慮到上樣液總黃酮質量濃度越高，上樣液體積越小，吸附時間則越短，所以選擇6 mg/mL為最適宜的上樣液總黃酮質量濃度，此時，上樣液體積為117 mL。

圖7　上樣液總黃酮質量濃度對吸附效果的影響Fig. 7　Effect of total flavonoids concentration in sample on the adsorption efficiency

2.2.2上樣流速對吸附效果的影響

將已去除有機溶劑的MAR解吸液（總黃酮含量為702 mg），配制成總黃酮質量濃度為6 mg/mL的溶液，分別以上樣流速0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min通過已處理好的PA柱，收集吸附后的流出液，測定其總黃酮質量濃度并計算吸附率。

圖8　上樣流速對吸附效果的影響Fig. 8　Effect of sample flow rate on the adsorption efficiency

由圖8可知，上樣流速在0.5～2 mL/min之間時，吸附率分別為99.83%、99.65%、99.58%、99.57%，仍然都在99%以上。因此，為提高效率，選擇2 mL/min為最適宜上樣流速。

2.2.3不同洗脫液體積分數的動態洗脫曲線

圖9　洗脫液體積分數對解吸效果的影響Fig. 9　Effect of eluant concentration on the desorption efficiency

將吸附好的PA用4～5 BV蒸餾水沖洗，再分別用體積分數為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液以1 mL/min流速進行洗脫，每流出5 mL流出液收集并測定總黃酮質量濃度，并以洗脫液體積為橫坐標，總黃酮質量濃度為縱坐標繪制動態洗脫曲線，考察洗脫液體積分數和洗脫液體積對解吸效果的影響。

由圖9可知，體積分數為30%的乙醇溶液洗脫下來總黃酮較少，且峰形不集中，拖尾非常嚴重，這種拖尾現象導致了洗脫時間的延長和洗脫液體積的增大，當洗脫液體積達到200 mL時，流出液總黃酮質量濃度仍有0.260 mg/mL，此時解吸率只有55.9%。這可能是因為30%的乙醇溶液洗脫能力較弱，而一些黃酮化合物與PA形成較多氫鍵，結合力大，使得不易被洗脫[23]。50%乙醇溶液動態洗脫曲線峰形相對集中，稍有拖尾，55 mL的洗脫液能基本把黃酮洗脫下來，解吸率為72.88%。用70%乙醇溶液洗脫，洗脫液為20 mL時，流出液總黃酮質量濃度達到最高值，出峰較早，洗脫液為30 mL時，又出現一個峰值。這可能是由于PA的柱層析作用，根據吸附物質與PA結合力不同所以會被分開洗脫下來，不同的峰代表不同物質[24]。此時，洗脫液體積為55 mL，解吸率為77.77%，可能是70%的乙醇溶液能最大程度地降低PA和總黃酮的氫鍵作用。90%乙醇溶液動態洗脫曲線峰形較對稱集中，較70%乙醇溶液洗脫曲線出峰晚，且需65 mL乙醇溶液才能基本洗脫完全，此時解吸率為74.23%。因此，選擇55 mL、70%為最適宜的洗脫液體積和洗脫液體積分數。

2.2.4洗脫流速對解吸效果的影響

將吸附好的PA用4～5 BV蒸餾水沖洗，再用55 mL 70%乙醇溶液分別在0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的流速條件下進行洗脫，收集洗脫液，測定其總黃酮質量濃度并計算解吸 率。

圖10　洗脫流速對解吸效果的影響Fig. 10　Effect of eluent flow rate on the desorption efficiency

由圖10可知，解吸率在洗脫流速為0.5 mL/min時很低，之后隨著流速的加快解吸率迅速上升；流速為1 mL/min時，解吸率達到最大；流速從1～2 mL/min時，解吸率又隨著流速的加快而降低。因此，選擇1 mL/min為最適宜的洗脫流速，此時，解吸率為76.50%。

2.3總黃酮純度的測定結果

分別準確稱取20 mg純化前、經MAR純化后、經PA純化后的黃酮粉，精密加入5 mL 95%乙醇溶液進行溶解。測定溶液中總黃酮含量分別為2.20、2.89、3.23 mg/mL。再通過1.3.8節的公式計算出純度分別為55.00%、72.25%、80.75%。可見經MAR純化后純度提高了17.25%，純化效果較好。經PA化后的總黃酮雖然純度只提高了8.5%，但黃酮顏色由黃土赭色變成了象牙白，說明PA脫色效果較好。茅巖莓總黃酮用MAR與PA聯用法，純度提高了25.75%，說明此方法有一定的可行性。

3　結 論

本研究確定了MAR對茅巖莓總黃酮進行初步純化的最適宜工藝參數為：上樣液總黃酮質量濃度6 mg/mL、上樣液流速1 mL/min、上樣液體積130 mL；洗脫液乙醇體積分數70%、洗脫流速1 mL/min、洗脫液體積40 mL。在此條件下，茅巖莓總黃酮純度從55.00%提高到了72.25%。確定了PA對茅巖莓總黃酮第2次純化的最適宜工藝參數為：上樣液總黃酮質量濃度6 mg/mL、上樣液流速2 mL/min；洗脫液乙醇體積分數70%、洗脫流速1 mL/min、洗脫液體積55 mL。在此條件下，總黃酮純度提高到了80.75%。用MAR與PA聯用法純化茅巖莓總黃酮，純度提高了25.75%，而MAR法[25]純化茅巖莓總黃酮純度只提高了14.65%。因此MAR-PA聯用法達到了較好的純化目的，并使PA彌補了MAR在純化工藝上的不足，具有良好的應用前景，為實際生產提供了有效依據。

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Purification of Total Flavonoids from Ampelopsis grossedentata by Combined Use of Macroporous Adsorption Resin and Polyamide

JIN Huiming, GUO Hongying, TAN Xinghe*, LIU Menghao, WANG Feng, CAI Wen, ZHANG Yu, DENG Jiehong
(Key L aboratory for Food Science and Bio-Technology of Hunan Province, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha410128, China)

Abstract:Sequential column chromatographies on HPD-100 macroporous adsorption resin (MAR) and polyamide (PA) were used to purify total flavonoids from Ampelopsis grossedentata. The optimum adsorption parameters for HPD-100 MAR were determined as follows: sample concentration, 6 mg/mL; sample flow rate, 1 mL/min; and sample volume, 130 mL. Under these conditions, the percentage adsorption was 97.14%. The optimum desorption parameters were established as follows: eluent concentration, aqueous ethanol (70:30, V/V); eluent volume, 40 mL; and flow rate, 1 mL/min. Under these conditions, the percentage desorption was 94.10%. After the treatment with HPD-100 MAR, the purity of total flavonoids was inc reased from 55.00% to 72.25%. The optimum adsorption parameters for PA were determined as follows: sample concentration, 6 mg/mL; and flow rate, 2 mL/min. Under these conditions, the percentage adsorption was 99.57%. The optimum desorption parameters were determined as follows: 70% ethanol in water (V/V) as the eluent; eluent volume, 55 mL; and flow rate, 1 mL/min. Under these conditions, the percentage desorption was 76.50%. After the treatment with PA, the purity of total flavonoids was further increased to 80.75%. The method presented in this study can provided a promising approach for the efficiency purification of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata.

Key words:Ampelopsis grossedentata; total flavonoids; macroporous adsorption resin; polyamide; purification

收稿日期：2015-10-14

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31371817）；湖南省自然科學基金項目（2015JJ3076）

作者簡介：金慧鳴（1990—），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工技術。E-mail：279697317@qq.com

*通信作者：譚興和（1959—），男，教授，博士，研究方向為農產品加工技術。E-mail：xinghetan@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612003 10.7506/spkx1002-6630-201612003. http://www.spkx.net.cn

中圖分類號：TS201.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0013-06