缺血后處理減輕大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷的實驗研究

李開濟，賀寶玲，盧秋玲，門秀麗，趙利軍

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缺血后處理減輕大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷的實驗研究

李開濟，賀寶玲，盧秋玲，門秀麗，趙利軍

摘要：目的觀察缺血后處理（I-postC）對大鼠肢體缺血再灌注（LIR）后肺損傷的影響，探討缺血后處理的器官保護作用及可能機制。方法Wistar大鼠24只隨機分為3組（n=8），對照組（Control組）、缺血再灌注組（IR組）和缺血后處理組（I-postC組）。結扎大鼠雙后肢根部以阻斷血流4 h，后再恢復血流灌注4 h，制作大鼠LIR動物模型。Control組橡皮帶松弛環繞雙后肢不阻斷血流，I-postC組在血流再灌注前，行重復3次的缺血5 min-再灌注5 min，再恢復4 h的血流再灌注。留取血液及肺組織標本，測定各組動物動脈血氣指標氧分壓［p（O2）］和二氧化碳分壓［p（CO2）］，檢測血漿及肺組織的丙二醛（MDA）含量及黃嘌呤氧化酶（XOD）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，光鏡及電鏡下觀察肺組織的病理形態學改變。結果LIR后p（O2）和p（CO2）明顯降低，血漿和肺組織中SOD活性明顯降低，而XOD、MDA明顯增加（P＜0.05）；鏡下可見肺間質內血管擴張充血，中性粒細胞浸潤，血管周圍間隙增大，肺泡間隔增寬，肺泡腔內有滲出液等損傷表現。與IR組比較，I-postC組p（O2）和p（CO2）明顯增加，血漿及肺組織SOD活性升高；而XOD、MDA水平降低（P＜0.05）；鏡下觀察肺組織只可見輕度病理改變。結論I-postC可通過抑制脂質過氧化反應減輕大鼠LIR后肺損傷的程度。

關鍵詞：再灌注損傷；肺；氧化性應激；丙二醛；黃嘌呤氧化酶；超氧化物歧化酶；缺血后處理

肢體缺血再灌注（limb ischemia reperfusion，LIR）損傷是臨床外科十分常見的病理現象。近年來國內外學者研究證實，在LIR發生過程中，機體其他遠隔器官也會受到累及［1］。肺臟是LIR中最易受累器官之一，急性肺損傷（acute lung injury，ALI）甚至急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是常見的危重表現形式［2］。積極探討減輕缺血再灌注對遠隔器官損傷的措施是目前研究的熱點之一，缺血后處理（ischemic postconditioning，I-postC）是本領域較新的研究成果，即在缺血組織得到長時間血流再灌注之前，先進行一次或數次短暫的缺血再灌注，通過激活機體內源性保護機制而減輕隨后持續再灌注引起的組織損傷。后續研究發現此保護作用同樣適用于遠隔器官及遠隔后處理［3］。本研究進一步從氧化應激（oxidative stress）的角度觀察I-postC對肢體缺血再灌注后肺組織的保護作用，并探討其病理生理學機制。

1　材料與方法

1.1動物與分組24只健康清潔級Wistar大鼠購自河南醫科大學實驗動物中心（質量合格證號：0001190），體質量200～250 g，普食喂養，動物使用許可證號：SYXK（冀）2010-0038。采用計算機輔助實驗動物隨機分組（CAR）程序［4］將動物隨機分為3組（n=8）：對照組（Control組），缺血再灌注組（IR組），缺血后處理組（I-postC組）。術前24 h禁食，自由飲水。

1.2模型制備及標本采集止血帶法制作大鼠LIR動物模型［1］，即：將動物乙醚淺麻醉，用標準化彈性的橡皮筋環繞結扎大鼠雙后肢根部阻斷血流4 h（硬質套管輔助），然后剪斷橡皮筋恢復血流灌注4 h。以結扎后雙后肢皮膚蒼白、溫度降低為缺血標準；以松解后局部皮膚逐漸變紅，溫度回升且腫脹等作為血流再灌注的標準，并輔以激光多普勒血流儀監測血流情況，綜合判斷篩選成功模型。Control組雙后肢僅松弛環繞橡皮筋，不阻斷血流，I-postC組則在血流再灌注前先行缺血5 min，再灌注5 min處理，并重復3次，再恢復血流持續灌注4 h。各組動物在再灌注4 h時經腹主動脈取血約0.5 mL（隔絕空氣，即將穿刺針頭插入橡皮塞內），立即送血氣分析，再取肝素抗凝血4 mL，經3 500 r/min離心15 min，所得血漿標本分裝在干凈的Eppendorf管中，-70℃保存備用。同時立即開胸取出肺臟，液氮速凍，-70℃儲藏備用。此外，每組取3份右肺中葉，切取2/3迅速投入4%甲醛溶液中固定，光鏡標本待用。將剩余1/3的組織塊立即投入冷4%戊二醛-磷酸緩沖液，后續處理后電鏡標本待用。

1.3指標及檢測 （1）血氣分析指標動脈血氧分壓［p（O2）］和二氧化碳分壓［p（CO2）］。穿刺腹主動脈取血約0.5 mL，立即隔絕空氣經雅培血氣分析儀（型號：i-STAT 300）檢測p（O2）和p（CO2）。（2）血漿超氧化物歧化酶（SOD）、黃嘌呤氧化酶（XOD）、丙二醛（MDA）水平。以凍存的血清標本為樣品，嚴格按照試劑盒（南京建成生物科技有限公司）說明書進行操作，利用比色法測定吸光度，通過各指標的公式計算出各樣本的結果。（3）肺組織MDA、XOD、SOD水平。將凍存的肺組織標本解凍并勻漿，3 500 r/min離心15 min，取上清液為測試樣品，余步驟同（2）。（4）肺組織光鏡觀察。切取的肺組織經4%甲醛溶液固定，常規脫水，包埋，切片，脫蠟，HE染色，透明，封片，觀察。（5）肺組織電鏡觀察。切取的肺組織立即投入冷的4%戊二醛-磷酸緩沖液，切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊預固定，后轉入2.5%戊二醛中固定，經丙酮脫水、環氧樹脂618包埋、超薄切片、染色后在透射電鏡（日立H-7650型）下觀察肺組織的超微結構。

1.4統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組動物p（O2）和p（CO2）結果與Control組比較，IR組和I-postC組的p（O2）和p（CO2）均明顯降低（P＜0.05），肺換氣功能障礙明顯。I-postC組較IR組p（O2）和p（CO2）有所提升（P＜0.05），低氧血癥和過度通氣有所緩解，見表1。

Tab.1　The values of p（O2）and p（CO2）of arterial blood gas in three groups表1　各組動物p（O2）和p（CO2）結果　（n=8，mmHg，x±s）

2.2各組動物血漿中MDA、XOD、SOD水平與Control組比較，IR組和I-postC組血漿MDA、XOD均明顯升高，SOD則降低（P＜0.05），全身脂質過氧化反應增強而抗氧化酶活性降低；I-postC組較IR 組MDA、XOD降低（P＜0.05），全身氧化應激損傷程度減輕，見表2。

Tab.2　The plasma values of MDA，XOD and SOD in three groups表2　各組動物血漿中MDA、XOD和SOD水平　（n=8，x±s）

2.3各組動物肺組織MDA、XOD和SOD水平與Control組比較，IR組和I-postC組肺組織MDA、XOD均明顯升高，而SOD降低（P＜0.05），肺組織處于氧化應激狀態；I-postC組較IR組，MDA和XOD降低，而SOD則升高（P＜0.05），I-postC有抑制脂質過氧化反應和保護自由基清除酶的作用，見表3。

Tab.3　The values of MDA，XOD and SOD of lung tissue in three groups表3　各組動物肺組織中MDA、XOD和SOD水平　（n=8，x±s）

2.4光鏡下肺組織形態學改變Control組肺組織結構完整清晰，無損傷表現。與Control組比較，IR組肺組織水腫，可見肺泡隔增寬，肺毛細血管充血擴張，大量炎性細胞聚集、附壁，血管周圍間隙增大。部分肺泡腔中可見出血和蛋白滲出物，并伴有局限性肺不張。而在I-postC組，肺組織結構損傷不及IR組嚴重，肺泡基本形態尚可，肺泡腔的滲出和充血不明顯，僅有輕度血管擴張和炎性細胞浸潤。見圖1。

2.5電鏡下肺組織形態學改變電鏡下可見Control組肺組織細胞及細胞器形態規整，無水腫、變形和變性等損傷表現。IR組可見肺泡毛細血管內皮細胞、Ⅰ型肺泡上皮細胞水腫變性，肺泡壁增厚，Ⅱ型肺泡上皮細胞膜微絨毛減少，線粒體腫脹、嵴減少，且胞質中板層小體明顯減少，肺間質水腫，細胞結構破壞。I-postC組細胞形態尚可，水腫不明顯，細胞損傷程度較IR組有所減輕，見圖2。

3　討論

近年來，在再灌注損傷的研究領域，缺血預適應（ischemic preconditioning，IP）和I-postC是備受矚目的兩大熱點［1，5］。雖然IP的器官保護作用是肯定的，但其需要在缺血發生之前就反復多次阻斷血流，在諸如血管栓塞等不可預見性疾病的防治中，IP的應用受到很大限制。和缺血不同，臨床上再灌注更多是可預見甚至可控制的過程［5］，因此I-postC有更強的實用性和可行性。有學者研究發現，通過“溫和再灌注”可以減少缺血器官的梗死面積和水腫程度，避免無復流現象，這也是對I-postC器官保護作用的有力支持［6］。在此基礎之上發展而來的遠隔后適應為保護遠隔器官開辟了新的研究領域，目前關于缺血后適應對LIR后肺臟的保護作用和機制值得關注。

Fig.1　The lungtissue structure of three groups under light microscope（HE，×200）圖1　各組肺組織結構光鏡觀察（HE，×200）

Fig.2　The lungtissue structure of three groups under electron microscope圖2　各組肺組織結構電鏡觀察

LIR可因嚴重的全身氧化應激反應引起肺組織的損傷［7］。肺氣體交換功能障礙是評價肺損傷程度的敏感指標［8］。本研究發現，再灌注后p（O2）和p（CO2）明顯降低，p（O2）降低是LIR致肺損傷，進而導致氣體交換功能明顯障礙的直接表現，低氧進一步刺激外周化學感受器，反射性引起呼吸的加深加快，CO2排出過多［9］，從而使p（CO2）也明顯降低。光鏡下和電鏡下肺組織的病理變化是肺氣體交換功能障礙的結構基礎。缺血及血液再灌注可經多種途徑激活XOD而催化大量自由基生成。性質相對穩定的MDA可間接反映體內自由基水平和脂質過氧化反應的程度。自由基清除酶SOD的降低與缺血缺氧使其生成不足、消耗過多以及被激活的中性粒細胞攜帶至炎癥部位等因素密切相關［10］。而I-postC組血漿中XOD、MDA水平明顯低于IR組，提示氧化應激程度有所減輕；血液SOD水平與IR組無明顯差異，可能與過多消耗而來不及合成補充有關系。血氣指標的變化也從功能方面驗證了I-postC抑制氧化損傷的作用，是肢體I-postC保護肺功能直接而有力的依據。

有研究表明，在I-postC的病理生理過程中，多種細胞外信號被激活，G蛋白偶聯受體作為啟動細胞內再灌注損傷補救通路（reperfusion injury salvage pathway，RISK）的橋梁，活化多種細胞內保護性蛋白，從而使組織細胞的損傷得以減輕［11］。在多次的肢體缺血及再灌注過程中，血液內皮源性的緩激肽、一氧化氮（NO）、前列腺素I2（PGI2）等是I-PostC遠隔組織保護作用的觸發器，可激活細胞內蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）及酪氨酸蛋白激酶（TPK）等，促進熱休克蛋白（HSP）或ATP敏感性K+通道的磷酸化［11］。另有報道，I-postC可延遲腺苷的清除，并激活細胞膜上腺苷A2、A3受體，阻止線粒體通透性轉換孔（mPTP）的開放，抑制細胞凋亡的發生［12］。這些細胞信號轉導效應的改變均有助于維持細胞骨架的完整性，在肺組織可減輕肺呼吸膜的損傷，提高肺換氣的效率。本研究著重從氧化應激的角度，證實了缺血后處理可通過抑制脂質過氧化反應減輕大鼠LIR后肺損傷的程度。I-postC是多因素參與、多路徑調節的復雜過程，它們之間相互調控，共同實現組織器官的保護作用。

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（2015-08-24收稿2015-12-03修回）

（本文編輯李國琪）

Experimental studies of ischemia postconditioning alleviated lung injury after limb ischemia reperfusion in rats

LI Kaiji，HE Baoling，LU Qiuling，MEN Xiuli，ZHAO Lijun
Department of Pathophysiology，Basic Medical College，North China University of Science and Technology，Hebei 063000，China Corresponding AuthorE-mail：786411506@qq.com

Abstract：ObjectiveTo observe the effects of ischemic postconditioning（I-postC）on lung injury after limb ischemia reperfusion（LIR）in rats，and to investigate the protective effect and the mechanisms.MethodsTwenty-four Wistar rats were divided into three groups:control group（group Control），ischemia-reperfusion group（group IR）and ischemic postconditioning group（group I-postC）.Referring to routine method in our department，the model rats underwent 4-hour ischemia and 4-hour reperfusion of hind limbs were made.In group Control，the rubber band around the limb was loose，which did not block the blood flow.Rats in group I-postC were given repeated 3 times of 5 min ischemia-5 min reperfusion，and then did perfusion 4 h before reperfusion.The blood and lung samples were collected for detecting arterial gas of partial pressure of oxygen［p（O2）］and partial pressure of carbon dioxide［p（CO2）］.The plasma and lung tissue levels of malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD）and xanthine oxidase（XOD）were detected.The morphological changes of lung tissue were observed under light microscope and electron microscope.ResultsIt was found that after suffering from ischemia-reperfusion，levels of p（O2）and p（CO2）decreased significantly.The activity of SOD in plasma and lung tissues decreased，but XOD and MDA increased significantly（P＜0.05）.With microscope，lung interstitial vascular dilation，infiltration of neutrophils，the width of the alveolar space，alveolar septal thickening and alveolar exudate were found.Compared with IR group，it was found that p（O2）and p（CO2）increased significantly in group I-postC.The activity of SOD in plasma and lung tissues increased，but XOD and MDA decreased significantly（P＜0.05）.The mild damage of pathological changes were found.ConclusionIschemic postconditioning can reduce the lung injury after limb ischemia reperfusion in rats，which may be related to the inhibition of lipid peroxidation.

Key words：reperfusion injury；lung；oxidative stress；malondialdehyde；xanthine oxidase；superoxide dismutase；ischemic postconditioning

中圖分類號：R363.2

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150003

基金項目：河北省衛生廳醫學研究重點課題（20130060）

作者單位：河北省唐山市，華北理工大學基礎醫學院病理生理學系（郵編063000）

作者簡介：李開濟（1994），男，臨床醫學專業本科生，主要從事肢體缺血再灌注損傷機制與防治的研究

通訊作者E-mail:786411506@qq.com