大鼠miR-142-3p、miR-145-3p表達模式分析

吳慧，趙宇龍，王艷紅，房興堂，陳宏，張春雷

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實驗研究

大鼠miR-142-3p、miR-145-3p表達模式分析

吳慧，趙宇龍，王艷紅，房興堂，陳宏，張春雷

摘要：目的篩選并鑒定對大鼠乳腺發育和泌乳調控起關鍵作用的微RNAs（miRNAs）。方法以U6為內參基因，運用實時熒光定量PCR，比較miR-142-3p、miR-145-3p在泌乳21 d大鼠乳腺、肝、心、脾、肺、腎、卵巢、子宮各器官的組織樣品表達量的差異及不同泌乳階段（1、7、21 d）乳腺組織miR-142-3p、miR-145-3p的表達規律。結果miR-142-3p在泌乳21 d各組織的表達存在差異，乳腺中的表達量顯著高于心、脾、肺、腎、卵巢和子宮，僅次于肝中的表達量（P＜0.05）。miR-145-3p在乳腺中的表達量顯著高于肝、脾和腎，而在心、肺、卵巢和子宮中差異無統計學意義（P＞0.05）。乳腺組織在泌乳1、7、21 d比較，miR-142-3p的相對表達量持續下調，而miR-145-3p的相對表達量先下調后上調。結論miR-142-3p和miR-145-3p在大鼠各組織及不同生理時期存在表達差異；miR-142-3p可通過調節靶基因催乳素受體（Prlr）來調控乳腺的發育和泌乳的形成，miR-145-3p可能具有與miR-145、miR-145-5p相似的功能。

關鍵詞：乳腺，動物；微RNAs；肝；心臟；脾；肺；腎；卵巢；子宮；大鼠，Sprague-Dawley；miR-142-3p；miR-145-3p；實時熒光定量PCR

母乳喂養是指用母親的乳汁來哺養嬰兒。母乳喂養有益于嬰兒和母親［1］。乳汁中的營養成分能促進嬰兒的健康成長，其抗體可以提高嬰兒免疫力［2］。此外，母乳喂養也利于母親的產后康復。然而很多產婦患有生理性泌乳困難，對于這一問題的解決還存在空白。因此，對泌乳機制的深入研究勢在必行。

微RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類在轉錄后調節基因表達的非編碼RNA。研究表明，miRNA在細胞增殖與分化、發育和凋亡、激素分泌、疾病發生等方面起著重要的調控作用［3］。目前，miRNAs多集中于乳腺疾病方面的研究［4］，其調控乳腺生長發育和泌乳的報道很少［5］。已有研究證實miR-142-3p可以調控乳腺上皮細胞的增殖和乳汁的合成［6］；而miR-145-3p通過靶向胰島素受體激酶底物 1 （IRS1）來調控脂肪的合成［7］。本實驗室已通過乳腺組織miRNA轉錄組測序，篩選出27個在乳腺中差異表達的miRNAs［8］。本研究以大鼠為模式動物，采用實時熒光定量PCR技術，對差異表達的miR-142-3p和miR-145-3p作進一步驗證并分析泌乳期不同階段miRNA的表達規律。

1　材料與方法

1.1實驗樣品實驗所用Sprague Dawley大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，相同條件下喂養，快速取泌乳1、7 d活體（各5個生物學重復）的乳腺組織及21 d活體（3個生物學重復）的乳腺、肝、心、脾、肺、腎、卵巢、子宮組織，于-80℃保存備用。

1.2主要試劑與儀器總RNA抽提試劑盒Trizol、反轉錄試劑盒［PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）］、熒光定量PCR試劑盒［SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）］均購于寶生物工程有限公司。臺式超低溫冰箱（德國Kendro Laboratory）；凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司）；紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Step One Plus型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.3引物的設計與合成大鼠miR-142-3p的反轉錄、熒光定量PCR引物通過Primer Premier 6.0軟件設計，并由上海生工有限公司合成。miR-145-3p、U6基因的反轉錄、熒光定量PCR引物購自Life Technology公司，miR-142-3p引物序列見表1。

Tab.1　The base sequences of primers for quantitative real-time PCR and reverse transcription表1　反轉錄和熒光定量PCR和反轉錄引物序列

1.4總RNA提取和反轉錄取0.1 g組織樣品，于預冷的研缽中加液氮研磨組織至粉末，加入1 mL Trizol，按總RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA。總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，將提取的RNA保存于-80℃備用。按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。

1.4.1總RNA中基因組DNA的去除2 μg總RNA，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser，RNase Free dH2O補加至10 μL，PCR儀中42℃2 min。

1.4.2cDNA的合成上述反應液10 μL中加入1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix，4 μL 5× PrimeScript Buffer 2，4μL RNase Free dH2O，總體積為20μL。混勻后37℃15 min，85℃5 s，反應結束后將cDNA放于-20℃備用。

1.5TaqMan探針法實時熒光定量PCR按照Takara公司的（SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ）試劑盒說明書進行操作，反應在Step One Plus熒光定量PCR儀上進行。反應體系（20 μL）：10 μL Probe Master，1 μL Primer Mix，1.5 μL cDNA模板，7.5 μL超純水。其中Primer Mix的配置方法：TaqMan探針（10 μmol/L）1 μL，上、下游引物（10 μmo/L）各7.5 μL，超純水9 μL。95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，重復40個循環；并進行熔解曲線分析。每個組織樣品做3次平行試驗，取其平均值，并在每批次實驗中設陰性對照。采用2-ΔΔCt法分析表達量，2-ΔΔCt越大說明miRNA在組織中的表達越強。ΔΔCt=（Ct實驗目的基因-Ct實驗管家基因）-（Ct對照目的基因-Ct對照管家基因），計算得到ΔΔCt值后再計算2-ΔΔCt值。

1.6靶基因預測和GO（Gene Ontology）分析首先利用Target scan6.2預測miR-142-3p、miR-145-3p的靶基因，將預測出的靶基因分別映射到GO數據庫（DAVID）中，根據假陽性率＜0.05和富集參數＞1.3，篩選出符合要求的基因本體分類條目。

1.7統計學方法實驗數據采用SPSS 17.0軟件分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1總RNA提取結果總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示有28 S、18 S及5.8 S 3條帶，28S、18S條帶清晰；經紫外分光光度計檢測，OD260/OD280=1.8～2.0，OD260/OD230＞2.0，表明RNA的濃度及完整性較好，可以用于后續實驗。

2.2大鼠 miR-142-3p組織表達譜分析大鼠miR-142-3p在各組織中的相對表達量（2- Ct均數±標準差）從高到低分別為肝、乳腺、肺、心、脾、卵巢、子宮和腎，且乳腺中的表達量顯著高于心、脾、肺、腎、卵巢和子宮，僅次于肝中的表達量（F=327.748，P＜0.05），見圖1。

2.3大鼠 miR-145-3p組織表達譜分析大鼠miR-145-3p在各組織中的相對表達量（2- Ct均數±標準差）從高到低分別為心、乳腺、肺、子宮、卵巢、肝、脾和腎，且乳腺中的表達量顯著高于肝、脾和腎，而在心、肺、卵巢和子宮中差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

Fig.1　Histograms showingthe relative expression differences of miR-142-3p in different tissues at day 21 of lactation圖1　泌乳21 d大鼠各組織中miR-142-3p的相對表達差異圖

Fig.2　Histograms showingthe relative expression differences of miR-145-3p in different tissues at day 21 of lactation圖2　泌乳21 d大鼠各組織中miR-145-3p的相對表達差異圖

2.4大鼠miR-142-3p和miR-145-3p在不同泌乳階段的相對表達譜（REP） 結果顯示，miR-142-3p的表達呈持續下降趨勢；miR-145-3p的表達先下調后上調，見圖3。

Fig.3　Expression profiles of miR-142-3p and miR-145-3p in different lactation stages圖3　miR-142-3p和miR-145-3p在不同泌乳階段的表達譜

2.5靶基因的預測和GO分析miR-142-3p的GO分析結果表明樣本在富集的功能上多集中于正調控大分子代謝過程、調控凋亡等；miR-145-3p的 GO分析結果表明樣本在富集的功能上多集中于正調控催化活性、突出神經元、調控信號轉導通路等，見圖4。

Fig.4　GO analysis of miR-142-3p and miR-145-3p圖4　miR-142-3p和miR-145-3p GO分析圖

3　討論

乳腺的發育和泌乳是一個極其復雜、高度綜合的過程，不僅受到激素、蛋白的調控，同時受到細胞因子、miRNA等的調控。miRNA主要通過與靶基因結合來調控乳導管和腺泡的發育、乳腺上皮細胞的活性［9］和增殖分化、乳蛋白合成［10］及乳糖代謝［11］。

miR-142-3p與miR-145-3p預測的靶基因中，其中Prlr［6］、IRS1、β-酪蛋白基因（CSN2）［12］等已被證實在乳腺發育和泌乳中發揮重要的調控作用。miR-142-3p與miR-145-3p的表達在大鼠各組織中存在差異，miR-142-3p在大鼠的乳腺、肝中表達豐度較高，進一步說明miR-142-3p參與乳腺生長發育的調控和乳脂的合成，這與李慧銘［6］的研究結果miR-142-3p通過靶向Prlr抑制乳腺上皮細胞的增殖和降低β-酪蛋白的分泌一致。miR-145-3p在乳腺、心、肺臟、卵巢和子宮中均高表達，表明其對生長發育、繁殖性能、呼吸系統等均起生物學作用，這與一個miRNA通過靶向多個靶基因，如髓細胞組織增生致癌基因（c-Myc）、八聚體結合蛋白-4（OCT4）等，參與多條信號通路途徑而發揮功能的結果相一致［13］。

Wang等［14］對小鼠乳腺不同發育階段miRNA進行研究發現，乳腺每一個發育階段都有它自己的miRNA表達譜，即在乳腺中的表達呈現時間特異性。miR-142-3p在泌乳1、7、21 d中表達下調。miR-142-3p通過抑制內源性Prlr基因和蛋白的表達［6］，來調控mTOR和JAK2/STAT5信號通路，進而抑制乳腺上皮細胞的活性、增殖能力及β-酪蛋白的分泌［15］。本研究中miR-142-3p在泌乳7 d的表達量急劇下降，說明此時乳腺上皮細胞的活性、β-酪蛋白的分泌能力很強。Lei等［16］研究報道，miR-145通過抑制鈣離子相關的RhoA1蛋白（ROCK1）的mRNA來抑制細胞增殖、侵襲和轉移，從而促進細胞的凋亡。Guo等［7］研究顯示miR-145-5p通過靶向胰島素受體能抑制脂肪的形成。本研究表明，miR-145-3p在泌乳7 d表達量最低，泌乳21 d呈明顯上升，推測miR-145-3p與miR-145、miR-145-5p功能相同似。

綜上所述，miRNA在乳腺組織發育和泌乳中發揮重要作用，但對其具體調控機制尚不清楚。因此，研究miRNA對正常乳腺發育和泌乳的調控具有重要意義，同時也為人類乳腺疾病的診治提供新思路。

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（2015-08-20收稿2015-11-10修回）

（本文編輯李鵬）

The expression pattern of miR-142-3p and miR-145-3p in rat tissues

WU Hui，ZHAO Yulong，WANG Yanhong，FANG Xingtang，CHEN Hong，ZHANG Chunlei
School of Life Science of Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China Corresponding AuthorE-mail:clzhang@jsnu.edu.cn

Abstract：ObjectiveTo screen and identify the key miRNAs during mammary gland development and milk secretion of rats.MethodsGene U6 was taken as interior label gene by real time-PCR to compare the differences of expression levels of miR-142-3p and miR-145-3p in the mammary gland，liver，heart，spleen，lung，kidney，ovary and uterus after 21 postpartum. Moreover，the expressions of miR-142-3p and miR-145-3p in different stages（1，7 and 21 d）of lactation were summarized. ResultsThere was significant difference in miR-142-3p in lactation 21 d between different tissues.The expression of miR-142-3p was significantly higher in mammary gland than that in heart，spleen，lung，kidney，ovary and uterus tissues，which was second only to the expression in liver（P＜0.05）.The expression of miR-145-3p was significantly higher in mammary gland than that in liver，spleen and kidney.There was no significant difference in the expression of miR-145-3p between heart，lung，ovary and uterus（P＞0.05）.Furthermore，the relative expression level of miR-142-3p was continuing downward continued to decline in breast at different stages of lactation，while the relative expression level of miR-145-3p was up-regulated after downregulating.ConclusionmiR-142-3p and miR-145-3p are differentially expressed in different tissues and physiological periods in rats.In addition，miR-142-3p can regulate the growth of mammary gland and the formation of lactation by targeting prolactin receptor（Prlr），miR-145-3p may have the same function with miR-145 and miR-145-5p.

Key words：mammary glands，animal；microRNAs；liver；heart；spleen；lung；kidney；ovary；uterus；rats，Sprague-Dawley；miR-142-3p；miR-145-3p；real time-PCR

中圖分類號：R349.6

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150116

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31472077）

作者單位：江蘇師范大學生命科學學院（郵編221116）

作者簡介：吳慧（1989），女，碩士研究生，主要從事乳腺分子生物學研究

通訊作者E-mail：clzhang@jsnu.edu.cn