Raf-1基因重組腺病毒siRNA載體構(gòu)建及其對(duì)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響

鄭亞萍，劉春杰2

（漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校1.生理教研室，2.藥理教研室，河南漯河 462002）

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Raf-1基因重組腺病毒siRNA載體構(gòu)建及其對(duì)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響

鄭亞萍1，劉春杰2

（漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校1.生理教研室，2.藥理教研室，河南漯河 462002）

【摘要】目的 構(gòu)建特異性抑制大鼠Raf-1基因的重組腺病毒載體，并將其體外轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞中進(jìn)行功能鑒定。方法 合成針對(duì)大鼠Raf-1的靶序列及陰性對(duì)照序列，經(jīng)退火形成的DNA雙鏈定向克隆到穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV中獲得pAdTrack-siRaf-1質(zhì)粒，PmeI線性化后在BJ5183細(xì)菌中與pAdEasy-1骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組獲得pAd-siRaf-1質(zhì)粒，后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝獲得pAd-siRaf-1腺病毒顆粒，繼而感染原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，通過Western blot方法檢測(cè)siRNA對(duì)Raf-1、NF-κB基因的抑制效率，液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定3H-亮氨酸（［3H］-leu）摻入率，用HJ2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞表面積。結(jié)果 重組腺病毒載體經(jīng)酶切、鑒定正確，制備的病毒感染效率高，攜帶Raf-1的病毒顆粒能夠在蛋白水平有效抑制Ang II誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Raf-1的表達(dá)、細(xì)胞表面積及［3H］-leu的增加并下調(diào)Raf-1、NF-κB表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建了pAd-siRaf-1重組腺病毒載體，并在HEK293細(xì)胞中包裝成重組腺病毒，轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表達(dá)，抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

【關(guān)鍵詞】Raf-1；小干擾RNA；重組腺病毒載體；心肌細(xì)胞；大鼠

Raf-1蛋白是由raf基因編碼的蛋白產(chǎn)物，可通過Raf-1蛋白激酶磷酸化而激活，Raf-1蛋白激酶是RAF/NF-κB等信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要信號(hào)分子，被激活的Raf-1過表達(dá)與細(xì)胞增殖、應(yīng)激甚至與凋亡密切相關(guān)［1，2］，但目前Raf-1對(duì)心肌肥厚中的作用還存在一定的爭(zhēng)議。研究顯示RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)大鼠心肌有明顯的促肥厚效應(yīng)，但也有報(bào)道提示抑制RAS/RAF激活并不能減輕心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)［3，4］。另一方面，目前在心肌肥大細(xì)胞模型中，暫無明確研究證明NF-κB與心肌細(xì)胞肥大的關(guān)系，且RAF/NF-κB等信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)心肌肥大的作用也少見報(bào)道，尚需進(jìn)一步研究。本研究的目的在于擬構(gòu)建大鼠Raf-1siRNA腺病毒載體，轉(zhuǎn)染后觀察其對(duì)Raf-1蛋白表達(dá)的影響，并通過在基因水平沉默技術(shù)研究Raf-1及RAF/NF-κB等信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響，為探討Raf-1對(duì)心肌肥厚的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生2～3 d SD乳鼠，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2010-0002，使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2011-0001。

1.2材料及試劑

穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV質(zhì)粒、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1購(gòu)自 Stratagene公司、293細(xì)胞株購(gòu)自Invitrogen公司、感受態(tài)大腸埃希菌DH5a及BJ5183菌種來自本實(shí)驗(yàn)室留存；PacI、PmeI、KpnⅠ和Bgl II酶購(gòu)自New England Biolabs公司，Raf-1克隆抗體、NF-κB多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，［3H］-亮氨酸（［3H］-Leu）購(gòu)于中國(guó)原子能研究院。

1.3心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

取出生后2 d～3 d的SD乳鼠，在無菌條件下取出心室并剪碎，在0.1%胰酶消化后收集細(xì)胞，離心棄上清液，將所得全部細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，采用差速貼壁獲得心肌細(xì)胞，免疫組化染色顯示α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性率。

1.4Raf-1基因重組腺病毒siRNA載體構(gòu)建

1.4.1Raf-1 siRNA序列的設(shè)計(jì)：從GenBank中獲得SD大鼠基因核苷酸序列（NM-012639.2），通過http：//sirna.wi.mit.edu/home.php輔助設(shè)計(jì)出3條靶序 列，1.siRaf-1-1（1612-1630）：TTCCAGATGTTCCAGCTAA；2.siRaf-1-2（776-794）：ATGGATTTCGAT GTC AGAC；3.siRaf-1-3（2067 -2085）AGTCAAAGAAGAAAGGCCT，將所選取的序列進(jìn)行Blast，未發(fā)現(xiàn)同源序列，另設(shè)siRNA陰性對(duì)照（與人類及其他哺乳動(dòng)物非同源的無關(guān)序列）。人工合成針對(duì)Raf-1不同靶序列的3對(duì)及siRNA陰性對(duì)照序列1對(duì)引物，每對(duì)互補(bǔ)的單鏈模板DNA在正義鏈的5'端引入KpnⅠ酶切位點(diǎn)、在反義鏈的5'端引入BglⅡ酶切位點(diǎn)，環(huán) （Loop）的序列為5'-GCAAGAG-3'（表1）。

表1　Raf-1和陰性對(duì)照siRNA模板DNA序列Tab.1 Sequences of the Raf-1 and negative control siRNA template DNA

1.4.2重組腺病毒載體pAd-Raf-1-siRNA的構(gòu)建及鑒定：合成四對(duì)寡核苷酸經(jīng)95℃退火后形成雙鏈寡核苷酸，與Kpn I和Bgl II雙酶切pAdTrackCMV質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5a轉(zhuǎn)化，通過卡那霉素篩選并挑取單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒后分別進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定。用PmeI對(duì)pAdTracksiRaf-1和陰性對(duì)照pAdTrack-siCon穿梭載體進(jìn)行線性化，CIP去磷酸化后，在大腸桿菌BJ5183中與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行同源重組，獲取pAdsiRaf-1及pAd-siCon用帶有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板進(jìn)行篩選相對(duì)分子質(zhì)量大于pAdeasy-1質(zhì)粒，PacI酶切鑒定。

1.4.3腺病毒的包裝、擴(kuò)增和滴度測(cè)定：重組腺病毒載體經(jīng)PacI酶切、乙醇純化后，Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中。培養(yǎng)5 d～7 d后可見細(xì)胞出現(xiàn)貼壁細(xì)胞變圓，腫脹，即病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），待觀察到90%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE，將細(xì)胞在-70℃和37℃反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心5 min，收集原代病毒上清液，經(jīng)反復(fù)“感染-凍融-收集”，擴(kuò)增重組腺病毒至第四代后，合并濃縮病毒液，進(jìn)行病毒的滴度測(cè)定，病毒滴度（Pfu/mL）=107×平均GFP陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)/視野（100）

1.5心肌細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定

取出生2 d～3 d的SD乳鼠，在無菌條件下取出心室，剪碎、0.1%胰酶消化，收集細(xì)胞，離心棄上清液，將所得全部細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間不同，采用差速貼壁1.5 h，獲得心肌細(xì)胞。免疫組化染色（S-P法）觀察α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白反應(yīng)。

1.6Western blot檢測(cè)siRaf-1、NF-κB在肥大心肌細(xì)胞中的表達(dá)

胰酶消化細(xì)胞后，以每孔1.5×105/孔的心肌細(xì)胞數(shù)接種6孔板，用獲得重組腺病毒按50MOI的量分別感染心肌細(xì)胞的同時(shí)加用10-7mol/L Ang II，另設(shè)Ang II組（單用10-7mol/Lang II）及空白心肌細(xì)胞組（不加處理因素），48 h收集細(xì)胞后提取各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)，電泳、轉(zhuǎn)膜后加封閉液，室溫封閉60 min；加入稀釋1∶2 000 Anti-rat Raf-1、1∶500 NF-κB一抗孵育，4℃搖床過夜；洗滌3次用封閉液1∶5 000稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h；漂洗后加顯色劑，避光顯色2 min～5 min，條帶出現(xiàn)，終止反應(yīng)，以 β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行比較。

1.7心肌細(xì)胞大小測(cè)定

每孔1.5×105/孔的心肌細(xì)胞數(shù)接種6孔板，用獲得重組腺病毒按50MOI的量分別感染心肌細(xì)胞的同時(shí)加用10-7mol/L Ang II，另設(shè)Ang II組（單用10-7mol/Lang II）及空白心肌細(xì)胞組（不加處理因素），胰酶消化脫落細(xì)胞后用相差顯微鏡拍照，每孔取10個(gè)視野，每視野取10個(gè)細(xì)胞，用HJ2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞表面積，取平均值。

1.8心肌細(xì)胞［3H］-Leu摻入率測(cè)定

加藥物干預(yù)的同時(shí)加入［3H］-Leu（3.7×104 Bq/孔），培養(yǎng)48 h后用PBS液充分沖洗，再將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾膜上，用預(yù)冷的10%三氯乙酸和PBS沖洗，裂解液裂解細(xì)胞30 min，收集細(xì)胞裂解液置于含閃爍液的液閃杯中，用液體閃爍儀測(cè)定放射性強(qiáng)度（dpm）。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

四對(duì)siRNA單鏈寡核苷酸成功退火，合成四個(gè)雙鏈DNA模板，得到約100 bp的兩個(gè)片段。抽提pAdTrack-siRaf-1和 pAdTrack-siCon質(zhì)粒后分別進(jìn)行Kpn I和Bgl II雙酶切鑒定，出現(xiàn)約9 000 bp和小于100 bp兩片段（圖1）；將構(gòu)建成功的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1在BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，成功重組的腺病毒載體經(jīng)PacI酶切后應(yīng)出現(xiàn)一條大于23 kb，另一條帶約為4.3 kb（圖2），測(cè)序鑒定明3個(gè)針對(duì)不同靶序列的Raf-1及陰性對(duì)照表達(dá)載體正確無誤。

2.2重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

pAd-siRaf-1及pAd-siCon轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染2 d后，倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，培養(yǎng)細(xì)胞10 d后可觀察到90%以上細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白（圖3）。收集、重復(fù)感染293細(xì)胞擴(kuò)增病毒后，用GFP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行滴度測(cè)定，病毒滴度分別為3.8×1010pfu/mL和3.5×1010pfu/mL。

2.3心肌細(xì)胞鑒定

心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有多個(gè)偽足伸出；免疫組化染色顯示，α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)即為心肌細(xì)胞，取20個(gè)視野統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞陽(yáng)性率測(cè)得心肌細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)96.2%（圖4、圖5）。

2.4pAd-siRaf-1表達(dá)重組腺病毒病毒對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積、［3H］-Leu摻入率及Raf-1、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

Ang II組心肌細(xì)胞表面積、［3H］-Leu摻入率及Raf-1、NF-κB蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組（均P ＜0.01）；siRaf-1-1～3重組腺病毒組心肌細(xì)胞表面積、［3H］-Leu摻入率及 Raf-1蛋白表達(dá)明顯低于Ang II組（均P＜0.05）；pAd-siCon與空白對(duì)照組相比無明顯差異（圖6，表1）。

圖1　KpnⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定重組穿梭質(zhì)粒1.pAd-siCon；2.pAd-siRaf-1-1；3.pAd-siRaf-1-2；4.pAdT-siRaf-1-3Fig.1 pAdTrack-siRaf-1 identified by Kpn I and Bgl II digestion

圖2　PacI酶切鑒定重組腺病毒載體Fig.2 pAd-siRaf-1 identified by PacI digestion

圖3　pAd-siRaf-1及pAd-siCon重組腺病毒包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)293細(xì)胞（標(biāo)尺=200μm）Fig.3 pAd-siRaf-1 and pAd-siCon recombinant adenovirus packaged and transduced into 293 cells（Bar=200）

圖4　培養(yǎng)3 d的心肌細(xì)胞（標(biāo)尺=100 μm）Fig.4 Cardiomyocytes cultured for 3 days（Bar=100 μm）

圖5　心肌細(xì)胞S-P染色（標(biāo)尺=50 μm）Fig.5 Cardiomyocytes with S-P staining（Bar=50 μm）

表2　重組腺病毒對(duì)心肌細(xì)胞Raf-1，NF-κB蛋白表達(dá)、表面積及［3H］-leu摻入率的影響Tab.2 Effect of recombinant adenovirus on the expression of Raf-1 and NF-κB proteins，the surface area and［3H］-leu incorporation of the cardiomyocytes（±s，n=6）

表2　重組腺病毒對(duì)心肌細(xì)胞Raf-1，NF-κB蛋白表達(dá)、表面積及［3H］-leu摻入率的影響Tab.2 Effect of recombinant adenovirus on the expression of Raf-1 and NF-κB proteins，the surface area and［3H］-leu incorporation of the cardiomyocytes（±s，n=6）

*P＜0.05，**P＜0.01，Compared with the control group；#P＜0.05，##P＜0.01 Compared with the Ang IIgroup.

NF-κB蛋白表達(dá)Expression of NF-κB protein組別Groups細(xì)胞表面積Surface area（μm2）［3H］-leu摻入率［3H］-leu incorporation（dpm）Raf-1蛋白表達(dá)Expression of Raf-1 protein Control　567.48±6.24　151.23±11.34　0.53±0.04　0.74±0.04 Ang II　1421.17±13.83**　387.47±21.13**　0.91±0.07**　1.51±0.11**Ang II+pAd-siCon　1572.38±9.24**　359.68±14.31**　0.86±0.03##　1.35±0.08**Ang II+pAd-siRaf-1-1　738.22±9.39*##　212.41±16.21*##　0.29±0.02**##　0.51±0.06*##Ang II+pAd-siRaf-1-2　1092.24±15.32**#　317.58±18.48**#　0.35±0.05*##　0.64±0.05##Ang II+pAd-siRaf-1-3　1191.41±16.52**#　328.24±13.22**#　0.55±0.04##　0.75±0.07##

圖6　重組腺病毒對(duì)心肌細(xì)胞中Raf-1及NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The expression of Raf-1 and NF-κB after the cardiomyocytes were transduced with pAd-siRaf-1 and pAd-siCon recombinant adenovirus

3　討論

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種新近發(fā)展起來的能有效阻斷基因表達(dá)的技術(shù)。本研究以含有表達(dá)綠色熒光蛋白基因的pAdTrack-CMV為穿梭載體，能方便的觀察轉(zhuǎn)染效果，利用缺失了腺病毒E1區(qū)基因骨架質(zhì)粒pAdeasy-1，避免腺病毒對(duì)靶細(xì)胞的損害；采用細(xì)菌內(nèi)同源重組AdEasy系統(tǒng)，構(gòu)建針對(duì)Raf-1基因的siRNA重組腺病毒載體，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將其轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，在該細(xì)胞中成功地包裝成含siRaf-1的腺病毒顆粒后，經(jīng)純化濃縮，滴度達(dá)到3.8×1010pfu/mL，轉(zhuǎn)導(dǎo)入大鼠心肌細(xì)胞，有效地沉默了Raf-1的表達(dá)，而無關(guān)序列構(gòu)建的陰性對(duì)照病毒，轉(zhuǎn)染效率與干擾病毒相當(dāng)，但不影響Raf-1表達(dá)。

心肌肥厚是心室重構(gòu)的重要病理學(xué)特征，與心肌缺血、心力衰竭等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，心肌細(xì)胞是心肌肥厚的主要效應(yīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大。Raf-1蛋白是由 raf基因編碼的蛋白產(chǎn)物，由648個(gè)氨基酸組成，有多個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)［5，6］，RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期停滯有關(guān)，對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞的肥厚反應(yīng)有重要的調(diào)節(jié)作用［7］，但也有報(bào)道提示抑制RAS/RAF激活并不能減輕心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Raf-1基因重組腺病毒siRNA研究其對(duì)心肌肥大的影響，發(fā)現(xiàn)pAd-siRaf-1-1～3重組腺病毒均能顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積及［3H］-Leu摻入率，提示pAd-siRaf-1重組腺病毒確具有抗心肌細(xì)胞肥大的作用，從基因水平證實(shí)Raf-1對(duì)心肌細(xì)胞肥大具有促進(jìn)作用。

NF-κB為轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員，靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白以非活性的形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞因子、LPS等刺激時(shí)，NF-κB激酶復(fù)合物IKKs（κB kinases）被激活，使 κB經(jīng)快速磷酸化、泛素化后降解，暴露出NF-κB的DNA結(jié)合域，NF-κB發(fā)生核移位并與相應(yīng)靶基因上特定的κB序列結(jié)合，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄［8］，Raf-1/MEK/ MAPK是激活I(lǐng)KK的主要信號(hào)通路［9，10］。研究表明NF-κB的激活參與糖尿病患者心肌細(xì)胞的凋亡，且其對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用在早期有抑制細(xì)胞凋亡而隨著時(shí)間推移，NF-κB的增多也引起了大量炎性因子的產(chǎn)生，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)，故細(xì)胞凋亡增多。大鼠心肌纖維化模型及體外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞研究均證實(shí)，抑制NF-κB可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制心肌纖維化［11，12］，RAF/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)心肌肥厚的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Raf-1基因重組腺病毒siRNA載體的能顯著下調(diào)心肌細(xì)胞Raf-1及NF-κB蛋白表達(dá)，pAd-siRaf-1-1的作用較pAd-siRaf-1-2～3作用更為明顯，說明pAd-siRaf-1對(duì)心肌肥大的抑制作用與下調(diào)Raf-1表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB表達(dá)有關(guān)，且對(duì)心肌細(xì)胞沉默Raf-1作用肥大抑制效果最佳的為pAd-siRaf-1-1，證實(shí)RAF/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在心肌肥厚的過程中不僅有成纖維細(xì)胞增殖的參與，心肌細(xì)胞肥大參與了此過程。

總之，Raf-1腺病毒siRNA能有效抑制心肌肥大，且其機(jī)制與下調(diào)Raf-1蛋白，進(jìn)而抑制RAF/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，通過在基因水平高選擇性地阻斷Raf-1、NF-κB的藥物也為治療心肌肥厚提供了新思路。

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〔修回日期〕2016-02-22

Construction and effect of recombinant adenovirus vector containing siRNA targeting Raf-1 on cardiomyocyte hypertrophy in neonatal rats

ZHENG Ya-Ping1，LIU Chun-Jie2
（1.Department of Physiology，2.Department of Pharmacology，Luohe Medical College，Luohe，Henan 462002，China）

【Abstract】Objective To construct an adenovirus vector expressing small interfering RNA（siRNA）targeting to rat Raf-1 gene and identify its function in cardiomyocytes.Methods The siRNA containing DNA sequence targeting to Raf-1 and its negative control sequence were designed，synthesized，annealed and subcloned into adenoviral shuttle vector pAdTrack-CMV.The recombinant adenovirus vector pAd-siRaf-1 was obtained by homologous recombination with pAdTrack-siRaf-1 linearized by PmeI and pAdeasy-1 in bacteria BJ5183，then transfected into HEK293 cells to package the adenovirus.Cardiomyocytes were infected with the adenovirus pAd-siRaf-1，and the expressions of Raf-1 and NF-κB protein were detected by Western blotting.［3H］-leu incorporation was evaluated by scintillation.The surface area of cardiomyocytes was measured using a HJ2000 image analysis system.Results The adenovirus vectors were verified by enzyme digestion and DNA sequencing.Compared with the Ang II group，Raf-1 and NF-κB expression，the surface area and［3H］-leu incorporation of cardiomyocytes were significantly decreased in cardiomyocytes infected with the adenovirus PAd-siRaf-1.Conclusions A recombinant adenovirus vector containing rat siRaf-1 gene is successfully constructed.It can effectively reduce Raf-1 and NF-κB expression and cardiomyocyte hypertrophy induced by Ang II.

【Key words】Raf-1；siRNA；Recombinant adenovirus vector；Cardiomyocytes；Rat

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）04-0018-06

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.004

［基金項(xiàng)目］河南省教育廳青年骨干教師資助項(xiàng)目（No.2013GGJS-271）。

［通訊作者］鄭亞萍（1976-），女，碩士，副教授，研究方向：循環(huán)生理學(xué)。