改良的乳小鼠心肌細胞原代培養方法

吳 丹，馮 健，莫顯剛，劉應才

（1.西南醫科大學附屬醫院心血管內科，四川瀘州 646000；2.貴陽醫學院附屬醫院老年病科，貴州貴陽 550004）

?

技術方法

改良的乳小鼠心肌細胞原代培養方法

吳 丹1，馮 健1，莫顯剛2，劉應才1

（1.西南醫科大學附屬醫院心血管內科，四川瀘州 646000；2.貴陽醫學院附屬醫院老年病科，貴州貴陽 550004）

【摘要】目的 建立一種穩定而快速的乳小鼠心肌細胞的原代培養方法。方法 用多聚賴氨酸預包被處理培養皿，采用兩步法（0.25%胰酶4℃過夜，0.5 mg/mL-1.0 mg/mL II型膠原酶 +5 mg/mL白蛋白的膠原消化液37℃短時多次消化），通過差速貼壁70 min+5-溴脫氧尿嘧啶的使用來純化心肌細胞。倒置相差顯微鏡下觀察心肌細胞形態變化，臺盼藍染色法檢測細胞存活率，α-actinin特異性免疫熒光染色鑒定心肌細胞并計算純度。結果心肌細胞形態良好，自發搏動，細胞成活率可達到98%，純度可達到95%。結論 本方法培養的心肌細胞存活率高，純度高，是一種理想的心肌細胞原代培養方法。

【關鍵詞】乳小鼠；心肌細胞；原代培養

目前，對于心血管疾病機制的研究，在器官與組織水平上，通過基因敲除和轉基因小鼠建立的心血管動物模型作出了極大的貢獻；在細胞分子水平上，原代培養心肌細胞作為一種體外實驗研究模型無可替代，它既能夠排除神經、體液、內分泌等因素的干擾而單獨地觀察研究心臟的發育以及心血管疾病的發生、發展機制［1］，同時具有自發搏動性，保持了其在體內的許多結構和功能。關于嚙齒類動物心肌細胞培養要追溯到20世紀60年代，Harary and Farley［2］首次從成年大鼠分離培養出心肌細胞。近些年來，大鼠心肌細胞的分離和培養技術越來越成熟，然而小鼠心肌細胞的分離與培養卻十分困難，由于心肌細胞為高度分化的近終末細胞［3］，喪失增殖分裂分化能力等特點，并且心肌細胞的培養存在存活率低、活力差、純度低、易于污染等問題，本實驗基于以往乳鼠心肌細胞的分離培養的經驗和方法加以改進［4，5］，建立了一種新型的乳小鼠心肌細胞的原代培養方法，此方法高效，穩定，能獲得大量的心肌細胞，活力好、存活率高、純度高。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗材料：出生0～3 d的乳小鼠，雌雄不限，SPF級 ，生產許可證：SCXK（川）2013-17，使用許可證：SYXK（川）2013-181。由四川醫科大學實驗動物中心提供。CO2培養箱，超凈工作臺，恒溫水浴箱，顯微眼科手術剪刀、鑷子三套，倒置相差顯微鏡，倒置熒光顯微鏡，恒溫離心機，澳洲胎牛血清（Bovogen），多聚賴氨酸，DMEM/F12培養基（Hyclone），胰酶，II型膠原酶（Gibico），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）（Sigma），青鏈霉素雙抗，40 g/L多聚甲醛，Triton X-100（Amresco），α-actinin（博士德），Dylight488標記的抗小鼠IgG（博士德），DAPI （Beyotime）。

1.1.2試劑的配制：配制含10%胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗的高糖DMEM/F12完全培養液，用完全培養液配制膠原消化液（0.5 mg/mL-1.0 mg/mL II型膠原酶 +5 mg/mL白蛋白）。

1.2實驗方法

1.2.1乳小鼠心肌細胞的分離、純化和培養：

1.2.1.1心肌組織的分離：取出生0～3 d的乳小鼠20只，浸泡于75%的酒精中8～10 s消毒后迅速送入超凈工作臺，將其固定于無菌泡沫板上，用眼科剪將乳小鼠胸骨正中偏左的皮膚剪開，用鑷子分離皮膚，充分暴露胸部，換另一把眼科剪做一縱向切口打開胸腔，盡量不要超出第一次剪開的皮膚范圍，忌打開腹腔，以免引起污染，根據心臟的搏動，順勢將心臟擠出。

取心臟放入冰冷的PBS緩沖液中吹打清洗，盡量將紅細胞清洗干凈，用眼科鑷輔助眼科剪將多余的心房及周圍肺組織等去除，隨后將心臟移到另一個干凈的培養皿，將心臟剪裂2～3下（裂而不斷的程度即可），共清洗3遍。（此步驟在冰上操作）。

1.2.1.2心肌細胞的分離與培養：將心臟組織吸入玻璃培養瓶中，加入0.25%胰酶（含EDTA）10 mL，靜置，4°C過夜（12～16 h）。第2天，取出過夜的心臟組織，加入完全培養液 10 mL，37°C恒溫水浴5 min，中止胰酶的消化作用；棄去上清液，加入膠原消化液10 mL（注意棄上清液時勿把心臟組織吸走）。置于37°C的恒溫水浴箱，1 min用手輕搖。棄上清液，將心臟組織移入另一個培養瓶中加入12 mL膠原消化液，置于37°C恒溫水浴箱上，用手輕搖30 min，將上清液移入新的離心管中。重復消化3～4次，僅見絮狀樣物質即心肌組織消化徹底。將收集的上清液離心1 000 r/min 5 min，棄上清液，加完全培養液30 mL，輕輕拍打管壁使得細胞懸浮于其中，隨后接種在100 mm培養皿中，放于37°C、5%CO2培養箱中孵育70 min，差速貼壁以除去成纖維細胞和內皮細胞等非心肌細胞。輕輕吸出細胞懸液，臺盼藍染液染色計數，根據不同的實驗目的用完全培養基調整細胞密度，加入BrdU使其在培養液的終濃度為0.1 mmol/L，輕輕混勻后，將其接種到在事先用多聚賴氨酸預包被處理過的6孔板中，37°C、5%CO2培養箱中孵育48 h后，換無BrdU的完全培養基，以后每隔48 h換液1次。

1.2.2臺盼藍染色檢測細胞存活率：取心肌細胞懸液90 μL加入0.4%臺盼藍染液10 μL均勻混合，靜置3 min左右后，取1～2滴已混勻的細胞懸液沿著蓋玻片邊緣滴入，將計數板放置于倒置相差顯微鏡下觀察計數，未著上色折光性強的圓形細胞為活的心肌細胞，染成藍色的為死細胞。隨機取4個視野進行細胞計數，計數心肌細胞的存活率（%）=活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%，重復計數計算5次。

1.2.3心肌細胞搏動和形態學觀察：將心肌細胞接種到多聚賴氨酸預包被處理過的100 mm培養皿中培養貼壁后，倒置相差顯微鏡下觀察心肌細胞的搏動頻率、節律、強度，以判斷心肌細胞的活力，觀察心肌細胞的生長狀態、形態學變化并拍照。

1.2.4心肌細胞純度鑒定（α-actinin免疫熒光染色）：將心肌細胞以1～2×105的密度接種于預先放有經多聚賴氨酸預包被處理過的無菌玻片的24孔板中，制成細胞爬片；貼壁培養48 h后取出爬片，用0.01 mmol/L的 PBS緩沖液漂洗3次，（每次2 min）；以40 g/L的多聚甲醛固定液固定5～10 min，每孔加0.5 mL，吸去固定液，用0.01 mmol/L 的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min；用3%Triton X-100室溫打孔通透30 min，吸去通透液，0.01 mmol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min（避免晃動）；加入200 μL 5%白蛋白37度孵育60 min，甩去多余液體，不洗；取1∶100稀釋的200 μL α-actinin抗體滴加到接種有心肌細胞的蓋玻片上，4°C冰箱過夜，用0.01 mmol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min；滴加1：100稀釋的Dylight488標記的抗小鼠IgG室溫避光孵育60 min，用0.01 mmol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min；用DAPI染液進行染核，室溫避光孵育3～5 min，0.01 mmol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次2 min；用吸水紙吸干爬片上的液體，滴加含抗熒光猝滅劑的封片液封片。熒光顯微鏡下觀察采集圖像，免疫熒光染色陽性的為心肌細胞，隨機取10個高倍鏡下視野計數陽性細胞數目及細胞總數，重復5次（陽性細胞率=陽性細胞數目/細胞總數 ×100%）。

表1　心肌細胞存活率的測定Tab.1 Determination of the survival rate of cardiomyocytes

2　結果

2.1心肌細胞分離純化、存活率測定及比較

實驗顯示，用多聚賴氨酸預包被處理培養皿，采用兩步法（0.25%胰酶4°C過夜，0.5 mg/mL-1.0 mg/mL II型膠原酶 +5 mg/mL白蛋白的膠原消化液37°C短時多次消化），可以獲得大量的心肌細胞，臺盼藍染色檢測細胞存活率可達98%以上（表1），明顯比傳統混合酶消化法（78.18%）、兩步法（90.47%）分離培養的心肌細胞存活率高（圖1）。此方法簡便、經濟、細胞貼壁培養好，利用差速貼壁法［6］除去成纖維細胞等非心肌細胞以及加入化學試劑BrdU抑制殘余成纖維細胞的生長增殖［7］，在培養2～5 d后觀察視野中絕大多數細胞為搏動的心肌細胞或者連接成片的心肌細胞團，未見明顯的成纖維細胞等非心肌細胞生長增殖。

圖1　3種方法培養心肌細胞的存活率及純度比較Fig.1 Survival rates and purity of the cardiomyocytes cultured by 3 methods.

2.2心肌細胞形態學觀察及比較

剛分離消化下來的心肌細胞懸浮于細胞液中呈圓形或者橢圓形，培養2～4 h后細胞開始貼壁生長，剛開始細胞呈單個、圓形，6～8 h后偶見單個心肌細胞搏動，搏動頻率較慢，呈梭形。24 h后細胞幾乎完全貼壁且均勻分布，伸出偽足，呈梭形、星形或不規則多邊形（圖2A），細胞搏動明顯，頻率和節律不一致，約60～100次/min不等；48 h后細胞伸出的偽足相互形成交聯，成簇成團，交織密集呈網狀（圖2B），呈同步收縮，約120～140次/min。通過多聚賴氨酸預包被培養皿 +兩步法分離培養的心肌細胞數目明顯比傳統混合酶消化法、兩步法分離培養的心肌細胞數目多（圖3）。

2.3心肌細胞純度鑒定及比較

在倒置熒光顯微鏡下可見：在胞漿中輔肌動蛋白（α-actinin）特異性染成綠色為免疫熒光染色陽性，DAPI染色的細胞核呈藍色（圖4，5），證實是心肌細胞；細胞胞漿不著色，胞核呈藍色的為非心肌細胞。結果顯示95%以上的細胞中α-actinin染色都為陽性（表2），純度明顯高于傳統混合酶消化法（75%）、兩步法（89.75%）分離培養的心肌細胞（圖1，5），可見該方法分離培養得到的心肌細胞純度高，少見其他非心肌細胞的生長。

圖2　普通光學顯微鏡下心肌細胞（標尺=200 μm）（A）Cardiomyocytes cultured for 24 hours；（B）Cardiomyocytes cultured for 48 hoursFig.2 Cardiomyocytes observed under a light microscope（Bar=200 μm）

圖3　普通光學顯微鏡下3種方法分別培養48h的心肌細胞（標尺=200 μm）（A）Traditional mixed enzyme digestion method；（B）Two-step method；（C）The polylysine pre-packs culture dish+two-step methodFig.3 Cardiomyocytes cultured for 48 hours in 3 methods，observed under a light microscope（Bar=200 μm）

表2　心肌細胞純度（±s，n=10）Tab.2 Purity of the cardiomyocytes（±s，n=10）

表2　心肌細胞純度（±s，n=10）Tab.2 Purity of the cardiomyocytes（±s，n=10）

實驗次數Experiment times心肌細胞純度/% Purity of cardiomyocytes/% 1 95.31±1.45 2 95.52±2.01 3 95.28±1.83 4 95.44±1.95 5 95.61±2.31

3　討論

近年來，關于心血管疾病研究的各領域，基于心肌細胞原代培養技術的信號通路、離子通道、基因表達等方面的探索研究，在細胞與分子水平揭示心血管疾病的發生發展及防治機制起著不可替代的作用。心肌細胞原代培養儼然已成為心血管研究中的一種根本方法和重要技術。目前，對于成年鼠心肌細胞的原代培養技術相對難度系數大，因此，乳鼠心肌細胞的原代培養技術更加應用廣泛。然而，乳鼠心肌細胞的原代培養各個過程極易受各種處理因素及相關操作水平的干擾，一直存在心肌細胞的貼壁率低、成活率低、搏動率少以及純度低等諸多不足，這些將會對隨后的相關實驗結果造成較大的影響，因此如何使消化分離下來的心肌細胞達到理想的成活率、純度是亟待解決的瓶頸問題。

心肌細胞的培養方法主要包括組織塊貼壁法和酶消化分離法兩種［8］。組織塊貼壁法［9］雖然操作簡便，經濟，但由于組織塊貼壁不良、培養周期長、含大量成纖維細胞等非心肌細胞且不是每一塊組織都能長出細胞，成功率低，現在已幾乎不用。酶消化分離法主要使用的酶是胰酶和膠原酶，胰酶不僅對組織間蛋白成分起分解作用還對細胞膜蛋白、胞內的微管微絲有很強的破壞作用，因此單獨的胰酶長時間的消化造成大量的心肌細胞喪失貼壁和自發搏動的能力，極大的影響細胞的活力和存活率，此外經胰酶消化處理后的組織可釋放出大量的絮狀般膠原蛋白，難以將上清液分離開，獲得的心肌細胞數目少且活力差。膠原酶主要是對細胞與細胞間的膠原纖維起分解作用，適當的應用膠原酶可將成團的心肌細胞充分分散開從而增加心肌細胞消化數目，其作用力緩和，對心肌細胞損傷小，但是難以完全消化。目前，大多數采用的是傳統混合酶（胰酶 +膠原酶）消化［10，11］，盡管分離消化下來的細胞數目多，但是仍存在細胞貼壁不佳、活性不好以及純度不高等問題。

圖4　心肌細胞的免疫熒光鑒定（標尺=200 μm）（A）Green is α-actinin specific staining；（B）Blue is the DAPI-stained cell nucleus；（C）Overlapping image of specific staining with α-actinin and DPAI-stained cell nucleus.Fig.4 Immunofluorescence identification of the cardiomyocytes（Bar=200 μm）

圖5　3種方法分別培養的心肌細胞（標尺=100 μm）（A）Traditional mixed enzyme digestion method；（B）Two-step method；（C）The polylysine pre-packs culture dish+two-step methodFig.5 Morphology of the cardiomyocytes cultured by the 3 methods（Bar=100 μm）

本文觀察了傳統混合酶消化法、二步法及多聚賴氨酸預包被處理+二步法分離培養的心肌細胞，結果顯示不論是存活率還是細胞純度二步法（0.25%胰酶4°C過夜，0.5 mg/mL-1.0 mg/mL II型膠原酶 +5 mg/mL白蛋白的膠原消化液37°C短時多次消化）分離培養的心肌細胞遠遠優于傳統混合酶消化法，而在二步法的基礎上，將培養皿進行多聚賴氨酸預包被處理后，不僅可以獲得更多的心肌細胞，而且細胞貼壁更好、成活率更高，形態結構正常，搏動好，純度更高。

（1）多聚賴氨酸預包被處理培養皿：由于小鼠的心肌細胞比較脆弱易損［12］，在實驗的各個步驟中分離消化時間和力度把握不佳，就會出現細胞貼壁不佳甚至幾乎不貼壁的現象，因此，用細胞外基質組分（如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、復合細胞外基質蛋白或者人工基質如多聚賴氨酸）來預包被細胞培養皿可促進心肌細胞貼壁生長［13］。

（2）0.25%胰酶（含EDTA）4°C過夜：EDTA是鈣離子的鰲合劑，一種非酶性消化物，主要作用是破壞細胞間的連接，在胰酶中加EDTA可增強胰酶的消化作用，降低對細胞的損害，具有更佳的消化效果，而胰酶在37°C，pH 8.0條件下消化作用最強，嚴重破壞心肌細胞，4°C條件過夜下可抑制胰酶的活性。加入0.25%胰酶（含EDTA）4°C過夜對心肌組織進行預消化，既能溫和緩慢地分解消化組織間蛋白，使緊密的組織結構變得疏松，也不會對細胞本身造成損傷破壞，提高細胞成活率。

（3）用完全培養液來配膠原消化液，既能終止胰酶對組織細胞蛋白的再消化，又能為細胞生存提供營養成分，避免在消化過程中造成對細胞的損害或者活力降低。由于乳小鼠心肌細胞對酶的消化特別敏感，如果酶的濃度過高或者用量過大，細胞將會喪失貼壁和搏動的能力，造成細胞成活率降低，但濃度過低，消化不足時，細胞將會聚集成團，造成細胞密度急劇減少，無法滿足后續實驗要求。Ⅱ型膠原酶的濃度控制在0.5mg/mL～1.0 mg/mL可達到理想的消化，在膠原酶中加入白蛋白（5 mg/ ml），保護細胞，提高消化分離的細胞質量。

（4）37°C短時多次消化，不僅可讓膠原酶充分消化組織，以便獲得足夠數目的心肌細胞，而且可降低因長時間的消化造成對細胞的損傷，避免出現消化過度以及隨之而來的細胞貼壁差，成活率低，搏動少，純度低等問題。由于小鼠心肌細胞比較脆弱，分離消化過程中，不宜用玻璃棒進行攪拌消化或吸管吹打消化，振蕩力度不宜過大，每次都應在37℃恒溫水浴輕輕震蕩下消化，以提高心肌細胞的獲得率。此外，溫度超過37℃時不但大大降低酶的活性，也會大大的降低細胞的活力；消化酶的作用時間對心肌細胞的獲得有很大影響，一般消化3～5次，每次消化時間應控制在8 min以內，消化時間過長、次數過多，則獲得的心肌細胞活力不佳，貼壁不良；時間過短，次數過少，消化不足，則獲得的心肌細胞量少。此外，應避免產生氣泡，因為氣泡的表面張力會牽拉損傷細胞。

本實驗通過長期反復的實踐證明，應用多聚賴氨酸預包被處理培養皿+兩步法分離消化心臟組織，聯合差速貼壁法（貼壁70 min）+化學試劑抑制法（在培養基中加0.1 mmol/LBrdU）純化心肌細胞，能夠建立一種理想的乳小鼠心肌細胞原代培養方法，有助于心肌細胞形態、電生理、生化、分子生物學及生物力學等方面實驗的開展，滿足心血管疾病基礎與臨床研究。

參考文獻：

［1］ Hadad I，Veithen A，Springael JY，et al.Stroma cell-derived factor-1α signaling enhances calcium transients and beating frequency in rat neonatal cardiomyocytes［J］.Plos ONE，2013，8（2）：e56007.

［2］ Harary I，Farley B.In vitro studies of single isolated beating heart cells［J］.Science，1960，131（3414）：1674-1675.

［3］ Anderson PA，Greig A，Mark TM，et al.Molecular basis of human cardiac troponin T isoforms expressed in the developing，adult，and failing heart［J］.Circ Res，1995，76（4）：681 -686.

［4］ 朱曉麗，王麗，馬依彤，等.乳鼠心肌細胞和心肌成纖維細胞體外分離培養方法的優化 ［J］.中國動脈硬化雜志，2015，01：90-99.

［5］ Louch WE，Sheehan KA，Wolska BM.Methods in cardiomyocyte isolation，culture，and gene transfer［J］.Mol Cell Cardiol，2011，51（3）：288-298.

［6］ 龐勇軍，孫莉，謝文娟，等.新生大鼠心肌細胞分離、純化及培養方法的改進［J］.上海交通大學學報：醫學版，2011，31 （4）：520-523.

［7］ Chiu CZ，Wang BW，Chung TH，et al.Angiotensin II and the ERK pathway mediate the induction of myocardin by hypoxia in cultured rat neonatal cardiomyocytes［J］.Clin Sci（Lond），2010，119（7）：273-82.

［8］ 司徒鎮強.細胞培養［M］.第2版.北京：世界圖書出版社，2007：54-57.

［9］ 王瓊，郭勇，余鴻，.乳鼠心肌細胞酶消化培養和貼塊培養法的比較［J］.中國比較醫學雜志，2006，01：38-40.

［10］ 辛毅，許秀芳，黃益民，等.乳小鼠心肌成纖維細胞和心肌細胞的分離培養及熒光鑒定 ［J］.新鄉醫學院學報，2011，28（5）：541-546.

［11］ 陽海鷹，丁巍，丁愛石，.新生小鼠心肌細胞培養模型的建立及其在毒性評價研究中的應用［J］.軍事醫學科學院院刊，2010，34（1）：30-33.

［12］ 王麗娟，賈大林，齊國先.成年小鼠心肌細胞的分離培養及鑒定［J］.中國實驗動物學報，2007，03：175-178.

［13］ Nawroth JC，Lee H，Feinberg AW，et al.A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion［J］.Nat Biotechnol，2012，30（8）：792-797.

〔修回日期〕2015-12-15

An improved method for primary culture of neonatal mouse cardiomyocytes

WU Dan1，FENG Jian1，MO Xian-gang2，LIU Ying-cai1
（1.Department of Cardiology，the Affiliated Hospital of Southest Medical University，Luzhou Sichuan 646000，China；2.Department of Geriatrics，the Hospital Affiliated to Guiyang Medical College，Guiyang 550004）

【Abstract】Objective To establish a stable and fast method for primary culture of mouse cardiomyocytes. Methods Dishes were coated with polylysine firstly.A two-step approach was used to isolate and digest mouse cardiomyocytes cells（0.25%trypsin in 4°C overnight and 0.5 mg/mL to 1.0 mg/mL collagenase+5 mg/mL albumin collagen digestion liquid in 37°C for short-time digestion），then the cardiomyocytes were purified through differential adhesion for 70 min and 5-bromodeoxyuridine（BrdU）.The cell morphology was observed under an inverted microscope. The survival rate of cardiacmyocytes was detected by trypan-blue staining and their purity was identified by α-actinin immunofluorescence staining.Results The cardiomyocytes were in good shape and pulsed spontaneously.The survival rate of the cardiomyocytes reached 98%and the purity was 95%.Conclusions This method described in this study is an ideal method for primary culture of mouse cardiomyocytes with a high survival rate and high purity.

【Key words】Neonatal mouse；Cardiomyocytes；Primary cell culture

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0062-06

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.011

［基金項目］國家自然科學基金（編號：31300946，31260250），滬州市人民政府-滬州醫學院科技戰略合作科技項目（2013LZLY-J22）。

［作者簡介］吳丹（1991-）女，碩士研究生，研究方向：冠心病的基礎與臨床，Email：15681536087@163.com。

［通訊作者］馮健（1982-）男，主治醫師，博士，研究方向：冠心病的基礎與臨床，Email：415623fj@163.com。