雙黃連注射液對肥大細胞組胺及己糖胺酶釋放的影響

葉 宇 柳 杰（大連醫科大學附屬第一醫院，遼寧 大連 116000）

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雙黃連注射液對肥大細胞組胺及己糖胺酶釋放的影響

葉 宇 柳 杰*
（大連醫科大學附屬第一醫院，遼寧 大連 116000）

【摘要】目的 建立雙黃連注射液評價肥大細胞介質釋放可行性。方法 不同濃度雙黃連注射液與大鼠體內肥大細胞共孵育，測定引起的組胺及己糖胺酶的釋放率，分析比較各組差異性。結果 陽性對照藥Compound 48/80能引起肥大細胞組胺及己糖胺酶的顯著釋放，不同濃度雙黃連注射液引起組胺及己糖胺酶釋放與生理鹽水組無差別。結論 大鼠肥大細胞自身釋放組胺及己糖胺酶較多，不適于體外評價雙黃連注射液引起過敏介質釋放。

【關鍵詞】過敏；肥大細胞；組胺；己糖胺酶

雙黃連注射劑是由金銀花、黃芩、連翹經提取制成的無菌的中藥復方制劑，具有清熱解毒、疏風解表等功效，對熱毒邪氣引起的發熱、咽痛、等疾病均有良好療效。臨床上常用于治療感染性疾病，尤其是呼吸道感染、肺炎、扁桃體炎、咽炎等。是國家中醫藥管理局確定的首批全國中醫院急診科必備中成藥之一，收錄在2005年版《中國藥典》中。但近年來，隨著臨床應用的日益廣泛，藥物不良反應（ADR）報道例數明顯增多，安全性問題引起人們的關注。

資料顯示，雙黃連注射劑致不良反應主要為急性過敏反應，其發生時間主要集中于首次給藥過程中及給藥當天，以用藥過程中的前30 min最為高發［1］。由此可見，雙黃連注射劑引起的急性過敏反應以類過敏反應為主，其發生機制為藥物成分直接作用于肥大細胞和嗜堿性細胞，而非抗原抗體反應。有研究表明，雙黃連注射液中的綠原酸及黃芩苷可能為其致敏性成分［2］，本研究通過雙黃連注射劑不同濃度對肥大細胞作用，測定其組胺及己糖胺酶釋放，從整體注射液整體方面評價其致敏性。

1　試劑與儀器

大鼠組胺ELISA測試盒購于北京中昊時代生物技術中心；PBS緩沖液及HBSS緩沖液購于Hyclone公司；雙黃連注射液，哈藥三精藥業，批號：06091313；Compound 48/80、4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide、Percoll分離液、臺盼藍、甲苯胺藍購于Sigma-Aldrich公司；Triton X-100購于Amresco公司，檸檬酸鈉、檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉購于天津科密歐化學試劑公司。

CellMate Ⅱ移液器（Matrix，USA）；Finnpipette可調式移液器（Thermo）；HZS-H水浴振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發公司）；酶標儀（Infinite M2000，Tecan）；生理鹽水（赤峰榮濟堂藥業有限公司）。

試驗動物：大鼠，♀，體質量200 g左右，購于大連醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號SCXK（遼） 2008-2002。

2　實 驗

2.1 雙黃連注射劑引起肥大細胞組胺及己糖胺酶釋放：參照文獻［3］方法，取健康雄性大鼠，眼球放血致死。剪開腹部皮膚，將皮膚向兩側翻開，腹腔注射15 mL不含鈣、鎂的HBSS緩沖液。注射后輕輕按摩腹部60 s，打開腹腔，腹腔內容物推向一側，吸管收集腹腔液于試管中，4 ℃，1500 rpm離心10 min，取細胞懸液，緩緩加入30%∶80%的Percoll梯度分離液中，4 ℃，2500 rpm離心15 min，以PBS液洗滌2次（4 ℃，1500 rpm離心10 min），收集界面細胞，懸浮于PBS中，調整細胞密度至5×105個/毫升，臺盼藍染色檢測細胞活力，細胞活力＞95%，甲苯胺藍染色，純度＞95%，待用。

細胞懸液100 μL加入EP管中，加入不同濃度藥品溶液200 μL， 37 ℃孵育30 min。4 ℃，1500 rpm離心10 min，吸取細胞上清液50 μL，按照上述方法測定細胞上清液中組胺及己糖胺酶含量。

2.2 ELISA方法測細胞組胺釋放率：上述細胞與藥物孵育30 min后，取上清液50 μL，按照組胺測試盒中標準操作規程測定并計算各濃度樣品溶液組胺釋放率。采用組胺對數濃度Log （C）與吸光度A做線性曲線，其線性方程為y=-0.5097x+1.2258，R2=0.9755。

2.3 己糖胺酶釋放率測定方法：上述細胞與藥物孵育30 min后，吸取50 μL上清液加入到含有50 μL以0.1 M檸檬酸緩沖液配制的濃度為1 M底物（4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide）的96孔板中，37 ℃孵育1 h，以0.1 M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液200 μL終止反應，于405 nm處測量吸光度值。各濃度樣品溶液引起的吸光度值與完全釋放組吸光度值比值為釋放率。

3　結果與討論

圖1 雙黃連注射劑引起肥大細胞組胺釋放

圖2 雙黃連注射劑引起肥大細胞己糖胺酶釋放

按照上述方法測得的雙黃連注射液引起肥大細胞組胺及己糖胺酶釋放，結果見圖1、2。目前，尚未有合適的以肥大細胞作為評價模型的藥物體外過敏反應評價方法。本實驗結果顯示，雖然Compound 48/80具有直接刺激肥大細胞釋放組胺及己糖胺酶的作用，其組胺及己糖胺酶釋放率可達80%，均顯著高于生理鹽水組。但是，雙黃連注射液不同濃度給藥組與生理鹽水組引起組胺及己糖胺酶釋放率未見差異，原因在于肥大細胞自發釋放的組胺及己糖胺酶較高，雙黃連注射液對其作用引起的這兩種介質的釋放較少或者不同濃度藥物引起兩種介質的釋放無差異。因此，雖然肥大細胞是過敏反應中過敏介質釋放的主要來源，但由于其自身釋放等原因，采用肥大細胞作為評價注射液釋放組胺及己糖胺酶的模型并不合適。

參考文獻

［1］ 程光文，曾婧，毛宗福.影響雙黃連注射劑不良反應的因素分析［J］.中國現代藥物應用，2010，4（4）:4-5.

［2］ 袁麗燕，黃洪林，涂海華.雙黃連注射劑的不良反應研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2010，10（17）:41-42.

［3］ 王欽富，王永奇，于超，等.炒紫蘇子醇提取物對肥大細胞脫顆粒及組胺釋放的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，2006，13（1）:30-32.

中圖分類號：R282.710.7

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）08-0028-01

*通訊作者：E-mail： heriness@126.com