漢灘病毒包膜糖蛋白假病毒的構建及特性研究

鐘　研，李金林，陳良君，楊占秋

(武漢大學醫學病毒學研究所,病毒學國家重點實驗室, 湖北 武漢 430071)

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漢灘病毒包膜糖蛋白假病毒的構建及特性研究

鐘研，李金林，陳良君，楊占秋

(武漢大學醫學病毒學研究所,病毒學國家重點實驗室, 湖北 武漢 430071)

【摘要】目的：研究漢灘病毒包膜糖蛋白與宿主細胞作用的分子機制，構建含有漢灘病毒(HTNV)標準株76～118株包膜糖蛋白的假病毒,并對其進行檢測. 方法：將表達漢灘病毒包膜糖蛋白的質粒和以VSVΔG為骨架的假病毒顆粒，與293T細胞共轉染，構建漢灘病毒的假病毒，用中和實驗，受體抑制實驗，免疫共沉淀和Western Blot對其抗原性、中和反應、受體作用等進行檢測. 結果：漢灘病毒假病毒與活病毒有相似的抗原特性，漢灘病毒假病毒可以模擬活病毒進入細胞的方式，其糖蛋白是以二聚體形式存在的. 結論：成功構建含有漢灘病毒標準株包膜糖蛋白的假病毒，它與活病毒的抗原特性和受體作用的方式相似，這為進一步研究漢灘病毒包膜糖蛋白與宿主細胞作用的分子機制提供了很好的工具.

【關鍵詞】漢灘病毒；包膜糖蛋白；假病毒；水泡性口炎病毒

0引言

漢坦病毒屬于布尼亞病毒科，主要引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和肺綜合征出血熱(hantavirus pulmonary symdrome， HPS)兩種疾病[1]. 包括我國在內的亞洲地區主要以漢灘病毒(hantaan virus， HTNV)和漢城病毒(seoul virus， SEOV)引起的HFRS為主，歐洲地區以普馬拉型(puumala virus，PUUV)，多布拉伐型(dobrava virus，DOBV)引起的HFRS為主，美洲地區主要由辛諾柏病毒(sin nombre virus，SNV)引起的HPS為主[2]. 漢坦病毒為單負鏈RNA病毒，由 L,M,S三個片段組成，L片段編碼病毒的RNA聚合酶，M片段編碼包膜糖蛋白(GN和GC)，S片段編碼核殼蛋白(NP). 其中包膜糖蛋白對病毒感染早期入胞，膜融合，晚期出胞等階段均具有重要作用，但其與宿主細胞相互作用的分子機制仍未完全明了，需要進一步研究. 目前，利用水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)為骨架構建的假病毒系統已經廣泛應用于研究RNA病毒的復制,外源糖蛋白的功能以及篩選藥物，疫苗評價等[3-7]，假病毒系統也已開始運用于漢坦病毒的研究[2,8-9]. 但是這些假病毒是否能完全模擬漢坦病毒的生物學活性及功能尚未見報道. 本研究制備了以水泡性口炎病毒為骨架的漢灘病毒標準株的假病毒，為深入研究漢坦病毒包膜糖蛋白與宿主相互作用機制及評價抗病毒藥物和疫苗效果提供手段.

1材料和方法

1.1材料漢灘病毒標準株76～118株活病毒由本實驗室長期保存. 293T細胞；Vero-E6細胞；Opti-MEM/LF2000(Invitrogen)，賓夕法尼亞大學的Robert Doms教授和Connie S.Schmaljohn 實驗室贈送了抗VSV-G和抗HTNV Gc的單克隆抗體HCO2和11E10. 新墨西哥大學醫院和智利的漢坦病毒研究組分別提供了抗SNV血清和抗ANDV的患者血清. 田納西大學的Michael Whitt教授和Robert Doms教授分別贈送了VSVΔG-GFP-VSVG和VSVΔG-luc-VSVG假病毒,pCMV-VSV-G質粒. 中質粒提取試劑盒(Omega). FLAG肽，M2抗 FLAG 抗體(Sigma).

1.2方法

1.2.1漢灘病毒包膜蛋白質粒的表達根據漢灘病毒標準株M片段的基因序列，對編碼區的密碼子優化之后，由公司(Menlo Park， CA，USA) 合成相應的序列，其含有KpnI和NotI酶切位點，以此酶切位點將M片段克隆到真核表達載體 pCDNA3.1中，形成表達漢坦病毒包膜糖蛋白的質粒，同時在GC蛋白的C末端加入了FLAG標簽便于檢測 .

1.2.2質粒擴增鑒定①將pHTNVMDNA質粒進行轉化擴增. 將連接好的質粒熱休克后加入37℃預熱的300 μLLB培養基(不含抗生素)輕輕混勻，然后固定到搖床上37℃震蕩1 h，取上述轉化混合液200 uL滴到含合適抗生素的固體LB培養皿中，用無菌玻璃棒涂布均勻，放入37℃恒溫培養箱過夜. 挑取固體培養基上的白色單菌落，接種于含有相應抗生素的20 mL LB液體培養基中，37℃，250 g振蕩培養過夜. 取培養物離心后，試劑盒提取質粒. ②用KpnI和NotI雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定質粒.

1.2.3假病毒的制備①接種293T細胞到6孔板中，待細胞80%左右融合后，進行轉染；②按LF2000說明書將LF2000與Opti-MEM，漢灘病毒表達質粒與Opti-MEM液分別混勻稀釋，然后再將兩種稀釋液混合均勻，室溫放置5 min；③將96孔板換新鮮培養基，然后將混合轉染液輕輕的滴入到平皿中，繼續培養6 h；④6 h后，去除轉染培養基以減少LF2000對細胞的毒性，加入新鮮的培養基(不含抗生素)到6孔板中；⑤繼續培養72 h后，將VSVΔG-GFP或VSVΔG-rLuc加入到DMEM原液中稀釋，更換細胞培養液，加入VSVΔG病毒稀釋液，37℃孵育2 h后，去除病毒稀釋液，用DMEM 原液洗細胞兩次，然后加入不含抗生素的2%DMEM的培養液，37℃繼續培養24 h；⑥從6孔板中收取上清到離心管后，2000 rpm，10 min離心，收取上清,然后加入Tris；⑦用濾器過濾后，分裝，待用.

1.2.4假病毒對VeroE6細胞的感染性的檢測①將veroE6細胞接種到96孔板中，待細胞長到單層后開始實驗；②將制備好的帶有Luciferase標簽的假病毒按照不同濃度進行稀釋后感染VeroE6細胞，孵育2 h；③棄去病毒液，用DMEM原液洗一遍，然后加入含2% DMEM維持液繼續培養16 h；④檢測細胞內Luciferase的量(RLU)即可反映假病毒對VeroE6細胞的感染性.

1.2.5血清或抗體對假病毒的中和作用的檢測①將veroE6細胞接種到96孔板中,待細胞長到單層后開始實驗；②先將Anti-VSV抗體mAb VSV稀釋到1 μg/mL，1∶50稀釋倍數稀釋患者血清，然后將帶GFP標簽的假病毒與血清或抗體稀釋液等體積混合，37℃水浴1 h；③將混合液加入細胞孔板中，培養24 h；④將培養液上清吸入EP管中，用胰酶消化細胞，將消化的細胞吸入到相應上清的EP管中；⑤1000 rpm，10 min離心后去除上清液，加入200 μL的稀釋液混勻；⑥流式細胞儀檢測感染假病毒細胞的量.

1.2.6抗β3整合素受體藥物Reopro對漢灘病毒假病毒的抑制作用①將Vero-E6細胞接種到96孔板中,待細胞長到單層后開始實驗；②將Reopro藥物用DMEM原液倍比稀釋后分別加入細胞培養板中50 μL/孔，孵育1 h；③將帶GFP的假病毒稀釋后加入等體積假病毒稀釋液到細胞培養孔，孵育1 h；④去除孵育液，洗2遍后，加入2% DMEM 細胞維持液，37℃，5% CO2繼續培養16 h；⑤在熒光顯微鏡下計算GFP 陽性細胞的個數.

1.2.7用免疫共沉淀方法檢測包膜糖蛋白是否以二聚體形式存在①將已制備好的漢灘病毒假病毒顆粒VSVG-luc用辛基糖苷裂解，然后用包被有抗 FLAG 的珠子進行免疫共沉淀，②沉淀洗脫后用抗FLAG 和抗GN抗體進行Western Blot試驗.

2結果

2.1漢灘病毒假病毒質粒的鑒定用KpnI和NotI酶進行雙酶切鑒定，結果瓊脂糖凝膠電泳跑出的片段與設計的質粒片段相符(圖1). 漢灘病毒標準株76～118 M片段質粒M片段長3616 bp,pCDNA3.1(-)為5428/5427 bp,總長度約為9044 bp，條帶K+N為雙酶切條帶，共有4個條帶，分別大概位置在3600 bp,5400 bp,9000 bp,11 000 bp左右，11 000 bp片段應該為質粒開環的構型，結果與預期一致，說明質粒構建成功.

2.2漢灘病毒帶GFP標簽假病毒制備通過上述的假病毒的制備方法，可以得到帶GFP綠色熒光的假病毒(圖2 A,B),圖A為漢灘病毒標準株包膜糖蛋白的假病毒(VSVG-HTNV-GFP)，滴度約為3.5×105IU/mL圖B為VSV與自身G蛋白質粒構建的假病毒(VSVG-VSV-GFP).滴度約為2×107IU/mL. 可以從圖中看出VSVG-HTNV-GFP比VSVG-VSV-GFP的滴度低，原因可能為VSV自身G蛋白可以更有效率的與VSV骨架組裝，VSV包膜糖蛋白的構象與漢灘病毒構象不同可能也影響其滴度.

2.3假病毒對易感細胞Vero E6的感染性的觀察假病毒稀釋成不同的滴度感染Vero E6細胞時，在10-2稀釋倍數其對vero-E6的感染量最高，約1.92×107，隨后隨著稀釋倍數增加，感染量逐漸降低，因此選用10-2的稀釋倍數進行后續實驗(圖3).

2.4漢坦病毒假病毒與HFRS患者血清的中和反應研究本研究用帶Luciferase標簽的假病毒與不同稀釋濃度的HFRS患者血清進行中和反應，其中患者血清已經用ELISA方法證實有抗體(圖4)，在稀釋1∶50時血清幾乎可以中和所有的假病毒，隨著稀釋度增加，假病毒中和的量也隨之越來越少. 這說明漢灘病毒假病毒與活病毒一樣可以與HFRS患者血清進行中和反應.

2.5漢灘病毒假病毒的抗原性研究將漢灘病毒活病毒，假病毒，分別與抗漢灘型漢坦病毒 Gc的單克隆抗體(HCO2和11E10)，抗VSV單克隆抗體 mAb VSV，SNV，ANDV以及 HTNV 抗血清(來源于HPS/HFRS患者的血清)進行反應(圖5)A與B比較觀察可知，假病毒與活病毒對單克隆抗體和HFRS患者血清表現出相似的抗原性，另外從圖中可觀察到抗VSV單克隆抗體mAbVSV對漢灘病毒假病毒基本沒有中和作用，僅對VSVΔG-VSV 有抑制作用，這就表明假病毒中的VSV骨架蛋白對漢灘病毒表面蛋白所產生的中和作用沒有明顯影響.

2.6 漢灘病毒假病毒與活病毒受體研究有研究[10]表明β3整合素受體在致病性漢坦病毒進入細胞中發揮了重要作用，但假病毒是否也可以利用β3整合素進入細胞尚不明確，因此我們用抗β3整合素的 Reopro藥物預先處理細胞(圖6A)，ReoPro藥物對漢灘病毒進入E6細胞的抑制率可達60%，對漢灘病毒假病毒的抑制率可達45%，說明ReoPro藥物可以同時減少致病性活漢灘病毒和假病毒進入細胞，但是觀察發現ReoPro藥物對VSVΔG-GFP-VSV并沒有抑制作用，說明假病毒的骨架對其利用受體進入細胞沒有影響. 另外我們用紫外UV滅活的HTNV 漢灘病毒預先與Vero-E6 細胞相互作用，處理組的假病毒進入細胞的量明顯被抑制(圖6B). 這說明假病毒與其活病毒利用相同的受體進入細胞.

2.7 漢灘病毒假病毒的包膜糖蛋白是以二聚體形式存在有研究[1]表明不同型別的包膜糖蛋白超微結構略有不同，但均以GN,GC二聚體形式存在，而漢灘病毒假病毒表達的包膜糖蛋白是否也是二聚體形式尚不清楚，本研究用抗FLAG 的M2 抗體結合到 6 μm 珠子上，然后用去捕捉Gc，然后用Western Blot的方法進行檢測，成熟的Gn和Gc分子量分別為68 kD和55 kD(圖7)，本研究用對沉淀洗脫后檢測，檢測到了Gn和Gc，表明漢灘病毒假病毒中Gn和Gc 是以二聚體形式存在.

3討論

近年來，HFRS的流行趨勢發生了變化，新的漢坦病毒的型別和亞型不斷出現，病毒的基因變異可能是其根本原因，而M片段編碼的GP蛋白承受來自宿主的免疫壓力最大，變異最為顯著，M基因編碼的GP蛋白在病毒進入宿主細胞，中和抗體形成，逃避機體免疫反應等與致病相關的環節密切相關[1]. 漢坦病毒感染與其他有包膜病毒相同，均是由包膜糖蛋白與宿主細胞膜上的受體特異性結合后啟動的. 所以研究包膜糖蛋白與受體的識別結合機制，對于后續尋找特異性藥物和疫苗抑制漢坦病毒感染起始，從源頭阻斷其進入細胞復制有著很重要的意義. 本研究利用VSV為骨架構建的假病毒系統帶有熒光標簽，可以更為方便的進行檢測，本研究中我們成功構建了漢灘病毒標準株的假病毒，并對其進行了鑒定，結果表明假病毒對易感細胞VeroE6具有很高的感染性，并且能與單克隆抗體和HFRS血清發生中和反應，假病毒中的GN和GC是以二聚體形式存在的,這是與活病毒的結構一致，這是發揮生理活性的基礎. 漢灘病毒與其假病毒不僅具有相同的抗原性，并且還利用相同

的受體進入細胞，這為應用假病毒來篩選抗漢坦病毒藥物及疫苗效果評價，研究G蛋白在致病中的分子機制都提供了很好的工具.

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Construction and identification of hantaan pseudovirions

ZHONGYan,LIJin-Lin,CHENGLiang-Jun,YANGZhan-Qiu

Institute of Medical Virology/State Key Laboratory of Virology, School of Medicine of Wuhan University, Wuhan 430071, China

【Abstract】AIM: To study the molecular mechanism of hantaanvirus (HTNV) envelope glycoprotein with host cell, and constructe pseudovirions of HTNV 76-118 strains. METHODS: It was constructed by incorporating of HTNV glycoproteins onto replication-defective vesicular stomatitis virus(VSV) cores in which the gene for the surface G protein has been replaced by the reporter gene. Antigenicity, neutral reaction and receptor function were detected by neutralization test, co-immunoprecipitation and flow cytometry. RESULTS: There was good concordance of the antigenicity and the way inside host cells between HTNV and its pseudovirions. Also, the glycoprotein GNand GCof pseudovirions existed as heterodimers. CONCLUSION: The pseudovirions are successfully constructed and the pseudovirions can be used to simulate the way of HTNV entry and antigenicity. This study provides a good stool for study on molecular mechanism of hantaan virus envelope glycoprotein.

【Keywords】hantaan virus; pseudovirions; vesicular stomatitis virus(VSV); glycoprotein

文章編號：2095-6894(2016)04-01-05

收稿日期：2016-03-04；接受日期：2016-03-20

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81371865)

作者簡介：鐘研. 碩士. 研究方向:漢坦病毒感染與免疫. E-mail:zy20160217@163.com 通訊作者:楊占秋. 教授. 研究方向:病毒進化與變異. E-mail:zqyang@whu.edu.cn

【中圖分類號】R373.9

【文獻標識碼】A

·基礎與轉化醫學·