高效液相色譜法與全自動免疫比濁法測定HbA1c的臨床應用研究

張超強賴春苗張力球巫廣平吳國平

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高效液相色譜法與全自動免疫比濁法測定HbA1c的臨床應用研究

張超強①賴春苗①張力球①巫廣平①吳國平①

【摘要】目的：探討高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）與全自動免疫比濁法（immunoturbidimetry，ITM）測定糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）的臨床應用。方法：選取2014年1月-2015年1月河源市龍川縣人民醫院內分泌科糖尿病患者115例（研究組）與體檢中心健康體檢者115例（對照組），全部研究對象均采用HPLC、ITM測定HbA1c水平，比較兩組HbA1c水平的差異，并分析兩種檢測方法的數據有效性、相關性、偏差與精密度的差異。結果：經Bland-Altman相對偏倚散點圖顯示，全部測量數據均在95%可置信區間（0.60，1.00）內，全部測量數據有效。研究組HbA1c水平均明顯高于對照組（P＜0.05），其中隨著HbA1c水平的降低，糖尿病并發癥發生率顯著降低，不同HbA1c水平的糖尿病并發癥發生率比較差異有顯著性（P＜0.05）。線性回歸分析顯示，HPLC與ITM檢測方法具有明顯的相關性（R2=0.9993）。偏差分析顯示，低、中、高值（HbA1c=4.0%～6.4%，6.5%～15.9%、16.0%）預測相對偏差均屬于可接受范圍。批內與批間精密度比較顯示，研究組變異系數（CV）明顯高于對照組（P＜0.05），而HPLC法的CV較低。結論：高效液相色譜法用于測定HbA1c與評估糖尿病并發癥發生風險中具有重要的意義，且其與ITM具有良好的相關性，準確度與精密度均較高，可作為臨床參考標準。

【關鍵詞】高效液相色譜法； 全自動免疫比濁法； HbA1c

①廣東省龍川縣人民醫院 廣東 龍川 517300

First-author’s address：Longchuan County People’s Hospital，Longchuan 517300，China

糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）在糖尿病初步篩查與診斷中具有明顯的優勢［1］。本研究通過比較高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）與全自動免疫比濁法（immunoturbidimetry，ITM）測定HbA1c的優劣勢，旨在提高HbA1c對糖尿病的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月-2015年1月本院內分泌科住院部的115例糖尿病患者作為研究組，全部患者均符合糖尿病的確診標準［2］。同期選取本院健康體檢中心的115例健康體檢者作為對照組。研究組：男50例，女55例，年齡35～55歲，平均（43.02±6.25）歲；對照組：男52例，女53例，年齡34～58歲，平均（42.98±6.31）歲。兩組研究對象性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）檢測儀器與試劑：高效液相色譜儀（VARIANT Ⅱ，美國伯樂公司），試劑采用原廠配套試劑。全自動免疫比濁檢測儀（AU2700全自動生化分析儀，美國貝克曼公司），全自動免疫比濁試劑盒（廣州科方生物技術有限公司）。（2）檢測步驟：全部研究對象均采用一次性EDTA-K2真空抗凝管采集靜脈全血，標本采集嚴格按照儀器說明書操作，冷凍保存待測。嚴格按照試劑盒說明書在高效液相色譜分析儀與全自動生化分析儀上，準確設定相關參數，檢測標本HbA1c水平。（3）質量控制：每份標本測定時同時測定2個質控品，分別采用高效液相色譜法與全自動免疫比濁法測定，每天測定的23份標本，按照正向順序1→23測定1次，再按照反向順序23→1重復測定1次，連續10 d，共230份標本。

1.3 觀察指標

1.3.1 有效性分析 以同份標本的平均HbA1c水平作為橫坐標，同份標本的比值（檢測樣本/參照樣本）作為縱坐標，繪制Bland-Altman相對偏倚散點圖，觀察離群點是否在95%可置信區間內，如全部測量數據均位于95%可置信區間內，如無需剔除離群點，則提示全部測量數據有效［3］。

1.3.2 HbA1c水平 比較兩組患者HbA1c水平的差異，分析不同HbA1c水平與糖尿病并發癥發生率的關系。

1.3.3 相關性分析 采用線性回歸分析高效液相色譜法與全自動免疫比濁法兩種測定方法的相關性。以HPLC檢測方法測定值作為橫坐標（X），ITM檢測方法測定值作為縱坐標（Y），計算直線回歸方程［4］。

1.3.4 偏差分析 以HbA1c=4.0%～6.4%作為低值，HbA1c=6.5%～15.9%作為中值，HbA1c≥16.0%作為高值，以2014年廣東省臨床檢驗中心臨床化學質量控制允許偏倚范圍的1/2（7.5%），計算低值、中值、高值的預測相對偏差與總誤差的差值，如總誤差-預測相對偏差＞0，則屬于可接受范圍，反之，總誤差-預測相對偏差＜0，則屬于不可接受范圍［5］。

1.3.5 精密度分析 采用重復性試驗，計算平均HbA1c水平與變異系數（coefficient of variation，CV），CV越小，其重復性越佳，CV＜5.0%則提示具有良好的重復性［6］。（1）批內精密度：任意取研究組與對照組標本各1份，1 d內同時測定20次。（2）批間精密度：任意取研究組與對照組標本各1份，冰凍保存，每天測定1次，連續20 d。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 X2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方法的測量數據有效性分析 本研究230份標本（230組數據）中，經Bland-Altman相對偏倚散點圖（圖1）顯示，95%可置信區間為（0.60，1.00），全部測量數據均在95%可置信區間內，無需剔除離群點，全部測量數據有效。

圖1 230份標本檢測結果Bland-Altman相對偏倚散點圖

2.2 兩組患者HbA1c水平比較 研究組HPLC、ITM檢測的HbA1c水平均明顯高于對照組，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 兩組患者HbA1c水平比較（±s） %

表1 兩組患者HbA1c水平比較（±s） %

組別　HbA1c（HPLC）　HbA1c（ITM）研究組（n=115）　11.26±0.25　11.27±0.27對照組（n=115）　5.16±0.17　5.17±0.18 t值　4.15　4.17 P值　　＜0.05　?。?.05

2.3 不同HbA1c水平糖尿病患者并發癥發生情況比較 HPLC、ITM檢測結果顯示：HbA1c＜6.5%糖尿病并發癥發生率明顯低于HbA1c=6.5%～9.0%、HbA1c＞9.0%，HbA1c=6.5%～9.0%糖尿病并發癥發生率明顯低于HbA1c＞9.0%，不同HbA1c水平糖尿病并發癥發生率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表2。

表2 不同HbA1c水平糖尿病患者并發癥發生情況比較 例（%）

2.4 兩種檢測方法相關性分析 根據HPLC與ITM檢測HbA1c水平（%）的線性回歸分析圖，直線回歸方程為Y=0.09901X+0.07，R2=0.9993，HPLC與ITM檢測方法具有明顯的相關性。

2.5 兩種檢測方法的偏差分析 兩種檢測方法的偏差分析顯示，總誤差-低值預測相對偏差＞0，總誤差-中值預測相對偏差＞0，總誤差-高值的預測相對偏差＞0，均屬于可接受范圍，詳見表3。

表3 兩種檢測方法的偏差分析

2.6 兩種檢測方法的精密度分析 批內與批間精密度比較顯示，研究組HPLC、ITM檢測的平均HbA1c水平與CV明顯高于對照組，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），其中HPLC檢測的CV稍低于ITM，但兩者比較差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表4。

表4 兩種檢測方法的精密度分析 %

3 討論

隨著生活方式與飲食習慣的改變，糖尿病發生率呈逐年增高的傾向，并成為全球常見的慢性內科疾病之一，嚴重影響身體健康與生活質量。HbA1c有助于反映糖尿病患者6～8周內的平均血糖水平，且不受胰島素、空腹、抽血時間與血糖波動等因素的影響。因此，HbA1c在糖尿病的診斷與治療中具有重要的意義。2010年美國糖尿病協會（American Diabetes Association，ADA） 將 HbA1c≥ 6.5%作為糖尿病的診斷標準，5.7%～6.3%作為糖尿病的高危人群［7］。2011年世界衛生組織（World Health Organization，WHO）正式采納HbA1c≥6.5%作為糖尿病的診斷標準［8］。目前，美國糖化血紅蛋白標準化計劃（AVUP）推薦采用高效液相色譜法（HPLC）作為HbA1c的檢測金標準［9］。但HPLC檢測方法的硬件條件較高，成本較高，不適用于基層醫院的推廣應用［10］。全自動免疫比濁法（ITM）操作較為簡便，成本較為低廉。但關于HPLC與ITM 在HbA1c中的測定價值研究罕見。

本研究結果顯示，經Bland-Altman相對偏倚散點圖顯示，全部測量數據均在95%可置信區間（0.60，1.00）內，全部測量數據有效。同時，糖尿病患者HbA1c水平均明顯高于健康體檢者，其中隨著HbA1c水平的降低，糖尿病并發癥發生率顯著降低，不同HbA1c水平糖尿病患者并發癥率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。揭示了HbA1c水平在糖尿病的診斷與糖尿病并發癥的預測中具有重要的價值。由于HbA1c是血糖與機體血紅蛋白相結合的產物，HbA1c水平與血糖濃度具有明顯的正相關，且HbA1c維持時間約為120 d，臨床上可將HbA1c作為糖尿病患者8～12周的血糖控制指標［11］。同時，由于HbA1c生成較為緩慢，性質較為穩定，不容易受短期血糖波動的影響。與空腹血糖、口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）相比，HbA1c檢測較為簡便，穩定變異性較低，依從性高，因此可作為糖尿病患者有效的篩查指標［12］。結合本研究結果，HbA1c水平越高，其糖尿病并發癥發生率越高，因此測定HbA1c水平有助于準確預測糖尿病腎病、糖尿病性視網膜病變與糖尿病性動脈粥樣硬化等糖尿病并發癥的發生風險。文獻［13］證實，HbA1c水平≤7.0%有助于控制糖尿病周圍神經血管病變的發生風險。線性回歸分析顯示，HPLC與ITM檢測方法具有明顯的相關性（R2=0.9993）。偏差分析顯示，低、中、高值（HbA1c=4.0%～6.4%，6.5%～15.9%、16.0%）預測相對偏差均屬于可接受范圍。批內與批間精密度比較顯示，糖尿病患者變異系數（CV）明顯高于健康體檢者，而HPLC法的CV較低。HPLC經重復性試驗顯示，糖尿病患者批內CV（3.2%），批間CV（4.1%），均低于5.0%，符合臨床檢驗要求，提示HPLC具有的檢測重復性較高［14］。糖尿病患者ITM的批內CV（3.9%），批間CV（4.6%），與HPLC具有明顯的相關性（R2=0.9993），且預測相對偏差位于可接受范圍之內，與文獻［15］的報道結果相一致。

綜上所述，高效液相色譜法用于測定HbA1c與評估糖尿病并發癥發生風險中具有重要的意義，且其與ITM具有良好的相關性，準確度與精密度均較高，可作為臨床參考標準。

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Clinical Application Research on High Performance Liquid Chromatography and Immunoturbidimetry for HbA1c Determination

ZHANG Chao-qiang，LAI Chun-miao，ZHANG Liqiu，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（12）：035-038

【Abstract】Objective：To investigate the clinical application of on high performance liquid chromatography （HPLC） and immunoturbidimetry（ITM） for hemoglobin A1c（HbA1c） determination.Method：From January2014 to January 2015 in Longchuan County People’s Hospital，115 cases diabetes patients from Endocrinology Department were selected as the study group，115 cases healthy people from Health Examination Center were selected as the control group，HbA1c levels of all subjects were determined by HPLC，ITM，HbA1c levels of two groups were compared，the differences of data validity，correlation，deviation and precision between two determinations were analyzed. Result： All data were measured by Bland-Altman relative bias，all data in 95% confidence interval（0.60，1.00），all data were validity.HbA1c levels of the study group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05），with the decrease of HbA1c level，the incidence rate of diabetes complications were significantly lower，and the difference of the incidence rate of diabetes was significant in different HbA1c levels（P＜0.05）.Linear regression analysis showed，HPLC and ITM detection were significantly correlated（R2=0.9993）.Deviation analysis showed，relative deviation of low，medium and high values （HbA1c=4.0%-6.4%，6.5%-15.9%，16.0%） were acceptable.Compared with the intra assay and inter assay，variation coefficient（CV） of the study group was significantly higher than that of the control group（P＜0.05），and CV of HPLC was lower.Conclusion：High performance liquid chromatography has important significance for HbA1c determination and diabetes complications risk assessment，and it has correlation with ITM，the accuracy and precision of HPLC are higher，it can be used as clinical reference standard.

【Key words】High performance liquid chromatography； Immunoturbidimetry； HbA1c

通信作者：張超強

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.12.010

收稿日期：（2015-11-12） （本文編輯：程旭然）