應用實時熒光定量RT-PCR技術快速檢測基因Ⅱ型諾如病毒的價值探討

姚秀林

（遼寧省撫順市疾病預防控制中心，遼寧 撫順 113006）

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應用實時熒光定量RT-PCR技術快速檢測基因Ⅱ型諾如病毒的價值探討

姚秀林

（遼寧省撫順市疾病預防控制中心，遼寧 撫順 113006）

【摘要】目的 研究探討實時熒光定量RT-PCR技術快速檢測基因Ⅱ型諾如病毒的臨床應用價值。方法 選取2015年4～9月在撫順市中心醫院收治因食物或懷疑由食物引起的感染性或中毒性就診病例82例，均通過采集患者糞便提取病毒RNA，并結合基因Ⅱ型諾如病毒特點采取熒光定量RT-PCR技術及常規RT-PCR進行檢測。結果 通過實時熒光定量RT-PCR方式對感染性或中毒性患者進行諾如病毒篩查診斷，其診斷檢出率明顯高于常規RT-PCR方式。結論 采取實時熒光定量RT-PCR檢測基因Ⅱ型諾如病毒具有良好的特異性與敏感度，可針對病毒標本濃度不同進行定量檢測，并能夠對諾如病毒疑似疫情或病例的快速鑒別診斷。

【關鍵詞】實時熒光定量；RT-PCR技術；檢測；基因Ⅱ型諾如病毒

諾如病毒屬于杯狀病毒之一，同時也是當前非細菌類急性胃腸炎疾病主要致病源，可在醫院、學校、餐館等人群密集地爆發急性胃腸炎，通過對諾如病毒不斷研究發現，人群致病諾如病毒大致分為GⅠ、GⅡ、GⅣ3個基因型，其中統計表明當屬GⅡ型諾如病毒最為高發［1］。過去臨床中對于諾如病毒的檢測多是通過酶聯免疫吸附實驗ELISA或逆轉錄-聚合酶鏈反應RT-PCR進行診斷，但其操作方式較為復雜、耗時長、易產生交叉污染等因素不利于臨床廣泛性篩查，并且在檢出率也尚有不足。而近幾年發展的實時熒光定量RT-PCR技術則通過定量檢測病毒，一步完成等優勢廣泛應用。為進一步探討實時熒光定量RT-PCR技術快速檢測基因Ⅱ型諾如病毒的價值，通過對收集的感染性或中毒性病例樣本進行不同方式對照檢測，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2015年4～9月在撫順市中心醫院收治因食物或懷疑由食物引起的感染性或中毒性就診病例82例，主要臨床表現為惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉（排便≥3次/天）且糞便性狀異常（稀水樣便、黏液便、膿血便）。均通過直接采集8～10 g糞便樣本置于-70 ℃環境下保存待檢。

1.2 病毒RNA提取方法：取糞便樣本2 g加入無菌液震蕩稀釋呈10%懸液，并8000 r/min離心5 min，靜置取上清液100 μL，參照QIAGEN RNeasy Mini Kit提取試劑說明書進行病毒RNA提取，并存放與-70 ℃環境冰凍保存。

1.3 實時熒光定量RT-PCR：cDNA合成：采用江蘇碩世生物科技有限公司生產擴增試劑為諾如病毒GⅡ核酸檢測試劑盒說明書配置RT-PCR反應液。反應體系配置：RT-PCR反應液7.5 μL，酶混合液5 μL，諾如病毒GⅡ反應液4 μL，去RNA酶水3.5 μL，病毒核酸/RNA 5 μL。PCR反應檢測諾如病毒GⅡ型采用引物COG2F/G2-SKR。反應條件：50 ℃ 30 min→95 ℃ 5 min預變性→95 ℃ 10 s變性55 ℃ 40 s退火、延伸及檢測熒光45cycle檢測通道：FAM、VIC。將具有反應的病毒RNA樣品建立3個不同濃度，均采取實時熒光定量RT-PCR檢測，并均采取五次重復性反應，結合變異系數驗證方法的重現性。

2 結 果

2.1 實時熒光定量RT-PCR反應重復性：通過對不同濃度的3個具有反應的病毒RNA樣品采取定量PCR檢測，并均重復性檢查5次，通過計算同一樣本Ct值的差異來驗證方法的準確性，見表1。

表1 熒光定量RT-PCR檢測諾如病毒的重復性

2.2 實時熒光定量RT-PCR技術與常規RT-PCR方法檢測結果：通過對82例患者糞便標本病毒RNA分別采取實時熒光定量RT-PCR技術與常規RT-PCR方法檢測，其結果表明實時熒光定量RT-PCR技術呈陽性標本檢出率顯著高于常規RT-PCR方法，詳見表2。

表2 實時熒光定量RT-PCR技術與常規RT-PCR方法檢測結果

3 討 論

諾如病毒基因亞型種類復雜切龐大，并具有極高的變異性，因此在采取PCR技術檢測中，需針對病毒敏感度、特異性指標針對病毒RNA進行研究并探討出較為廣譜的引物是極為重要的。目前臨床中RT-PCR方法在檢測中多將ORF1的聚合酶區段與ORF2的殼蛋白區段作為關鍵性引物與探針進檢測反應［2］，而國外學者Kageyama［3］通過針對諾如病毒RNA特點，選擇ORF1-ORF2交界處的N/S結構域設計，其引物具有良好的穩定性與保守度，尤為適用于諾如病毒基因分型診斷，其研究結果發現實時熒光定量RT-PCR技術在該項引物反應中具有良好的敏感性和特異性。諾如病毒在爆發感染后往往具有發病迅速、傳播范圍廣，特性消失早等問題，在面臨臨床診斷時就要求需在短時間內對巨大數量樣品性準確分析檢測，其實時熒光定量RT-PCR技術相比與常規RT-PCR技術具有更為突出的檢測敏感性及特異性，同時前者可采取閉管操作避免樣品交叉感染風險，降低了假陽性污染的頑弊，提升檢測質量及效率。并且在熒光探針的作用下增加檢測靈敏度，簡化操作步驟，無需重復實施酶切分析、探針雜交或序列測定等方式來明確驗證結果。總之實時熒光定量RT-PCR較為適用于對諾如病毒疑似疫情或病例的快速鑒別診斷，值得臨床應用。

參考文獻

［1］ 李志凱，蘇國成，蘇文金，等.諾如病毒檢測方法研究進展［J］.微生物學通報，2014，41（7）:1417-1424.

［2］ 夏體嬌，金敏，陳照立，等.熒光定量RT-PCR檢測諾如病毒基因Ⅱ型方法的建立和評估［J］.解放軍預防醫學雜志，2013，31（3）:200-203.

［3］ Kageyama T，Koji ma S，Shinohara M，et al.Broadlyreactive and highlysensitive assayfor Norwalk-like viruses based on real-ti me quantitative reverse transcription-PCR［J］. J Clin Microbiol，2003，41（4）:1548-1557.

中圖分類號：R45

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）03-0179-01