一例Ⅰ型神經纖維瘤病患者的NF1突變檢測及家系分析

過丹丹　盧鑫鑫　黃肖利　陳喜軍　張彪　鄭佳瑩　伍嚴安，★

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一例Ⅰ型神經纖維瘤病患者的NF1突變檢測及家系分析

過丹丹1盧鑫鑫1黃肖利2陳喜軍2張彪1鄭佳瑩1伍嚴安1，2★

［摘要］目的對1例臨床擬診為Ⅰ型神經纖維瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）患者進行致病基因突變研究。方法提取先證者及其家系成員外周全血基因組DNA，通過目標捕獲二代測序技術（targeted next-generation sequencing，TNGS）對先證者Ⅰ型神經纖維瘤蛋白基因（neurofibromin 1，NF1）的全部編碼區外顯子及其側翼序列進行高通量測序檢測可疑突變，并用Sanger測序法進一步驗證；對其家系成員NF1相同突變位點進行Sanger測序檢測。結果基因檢測發現先證者NF1第45號外顯子1個已知致病突變c.6790_6791insA（p.Tyr2264Ter），有類似臨床表現的父親和姐姐檢出相同突變，表型正常的母親和妻子未檢測到此突變，其4歲兒子也檢測出該突變。結論NF1的c.6790_ 6791insA（p.Tyr2264Ter）突變存在與該家系NF1的發病密切相關。

［關鍵詞］突變檢測；Ⅰ型神經纖維瘤病；NF1基因；目標捕獲二代測序

★通訊作者：伍嚴安，E-mail：wyaslyy@126.com

Ⅰ型神經纖維瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）（MIM#162200）是源于神經嵴細胞分化異常而導致多系統損害的常染色體顯性遺傳病，患病率約為1/2 500～1/3 000［1］。該病的臨床表現為皮膚咖啡牛奶斑、雀斑、多發神經纖維瘤、虹膜Lisch結節、虹膜錯構瘤、神經膠質瘤、骨骼異常等［2］。美國國立衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）于1988年提出了NF1的臨床診斷標準，包括其中2項或2項以上即可診斷為NF1［3］。該病是由于Ⅰ型神經纖維瘤蛋白基因（neurofibromin 1，NF1）（MIM#613113）突變及表達異常所致［4-5］。本研究用目標捕獲二代測序技術（targeted next-generation sequencing，TNGS）對一個NF1家系進行NF1突變的檢測。

1　材料與方法

1.1研究對象

先證者，男，32歲，漢族，于2015年因全身皮膚多發性結節到福建省立醫院皮膚科就診，按照NIH的診斷標準擬診為NF1。先證者的母親、妻子表型正常，父親和姐姐均有類似的皮膚表現。有一4歲兒子。家系圖見圖1。

1.2方法

1.2.1基因組DNA抽提

獲得研究對象知情同意后，抽取該先證者、父母、姐姐、妻子及兒子的外周靜脈血2 mL，均用EDTA抗凝。用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，德國）抽提全血基因組DNA。檢測所提取DNA的濃度及純度，質控標準為：DNA濃度＞100 ng/μL，總量＞5 μg，A260/A280比值范圍在1.8～2.0之間。

1.2.2TNGS及數據處理

檢測先證者合格的1 μg基因組DNA，使用超聲波儀（Covaris S2，美國）進行隨機打斷，產生200～250 bp的隨機片段。在片段兩端加接頭，進行文庫構建。使用定制的2.1 M芯片（customized capture array）（Roche NimbleGen，美國）進行目標序列捕獲。該芯片已經過大規模平行測序（massive parallel sequence，MPS）應用，顯示有良好的敏感性和檢測效率［6］。該芯片基因檢測的目標區域捕獲范圍包括NF1全部外顯子區域及其鄰近10 bp的側翼區。富集的 DNA庫在 Illumina HiSeq2000測序平臺上進行擴增并高通量測序。分別用SOAPsnp軟件和Samtools分析單堿基變異和插入/缺失。建庫、雜交、測序、序列比對及基因拷貝數變異分析的方法都與之前文章方法一致［6-7］。通過國際千人基因組計劃（the 1000 genome project）、NCBI單核苷酸多態性數據庫（NCBI dbSNP）、華大基因組數據庫（BGI-DB）、人類基因突變協會（Human Genome Variation Society，HGVS）命名規則、人類基因突變數據庫（the human gene mutation database，HGMD）等數據庫，明確是否存在突變及其性質。

1.2.3Sanger測序驗證

采用常規Sanger測序方法對先證者二代測序檢出的可疑突變所在外顯子區域進行測序驗證。使用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。第45號外顯子的上游引物序列：5′-CCGAGATTCAGTTTAGGAGTTA-3′；下游引物序列：5′-CGCTTGAGAACATACTATCCAT-3′，產物片段大小為376 bp。PCR反應體系：10×ExTaq buffer（Mg2+Plus）5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、20 μmol/L上下游引物各2 μL、DNA模板2 μL、ExTaq DNA聚合酶0.25 μL（TaKaRa，日本），去離子水補足至50 μL。用TP600PCR儀（TaKaRa，日本）進行PCR反應。PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸50 s，共36個循環；72℃延伸10 min。取2.5 μL產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對電泳顯示在相應位置為清晰單一條帶的PCR產物，用ABI3730測序儀（ABI，美國）進行DNA雙向測序。用同樣方法對先證者父母、姐姐、妻子及兒子進行45號外顯子的Sanger測序。

2　結果

2.1臨床特征

先證者自出生時即在軀干四肢發現幾處褐色斑，隨著年齡的增長，褐色斑逐漸增多增大，部分斑面增大發展為褐色斑片。青春期時，全身皮膚出現大量大小不一，呈粉紅色或膚色的孤立性結節，半球形，質地軟硬不等，部分有蒂，在面部、軀干、四肢均有分布，在軀干較多。曾因軀干部位結節摩擦導致疼痛多次手術切除治療。體檢在軀干四肢可見數百枚腫物，大小約為0.3～2.5 cm，觸之柔軟。在腋窩處可見大量大小不一的雀斑（圖2A、B、C）。眼科檢查在裂隙燈下雙眼虹膜均可見2個以上的Lisch結節，患者身高1.51 m，智力正常，視力與聽力正常，頭顱及脊柱磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）未見明顯神經系統異常，未見其他系統疾病。姐姐皮膚有類似表現，另曾于6年前因左外耳后神經纖維瘤進行手術切除，現又復發（圖2DE），MRI顯示左側外耳軟組織浸潤性病變。兒子4歲，軀干及四肢發現多處褐色斑，但無皮膚結節（圖2F）。

2.2TNGS結果及生物信息學分析

對NF1全部編碼區外顯子捕獲測序，目標區覆蓋度達到100.00%，平均測序深度（×）約為597，目標區平均深度＞30×位點所占比例約為99%（圖3）。在第45號外顯子檢測到一突變c.6790_ 6791insA（p.Tyr2264Ter），造成突變位點編碼酪氨酸的密碼子UAC變為終止密碼子UAA，導致蛋白質的翻譯提前終止，形成由2 264個氨基酸組成的截短多肽。經檢索為報道過的突變［8］。

2.3Sanger測序驗證及突變性質分析

Sanger測序證實了先證者存在c.6790_6791insA突變，其父親、姐姐及4歲兒子也檢測出該突變。表型正常的母親和妻子未檢測出此突變（圖4）。

3　討論

NF1定位于染色體17q11.2，包含57個組成性外顯子和3個可變剪接外顯子，全長283 kb，有3個大小為11～13 kb的成熟轉錄本。其蛋白產物為神經纖維瘤素，由2 818個氨基酸組成，大量表達于神經元、星型膠質細胞、少突膠質細胞、許旺細胞、腎上腺細胞、性腺細胞和白細胞。NF1是腫瘤抑制基因，其突變可干擾Ras循環的cAMP信號轉導通路從而引發腫瘤［9］。NF1表達的丟失導致神經纖維素RasGAP功能的喪失，最終導致RAS活性的增加、細胞增生以及腫瘤的形成［10］。本研究通過TNGS和Sanger測序驗證確定先證者家系存在遺傳學病因——c.6790_6791insA突變。c.6790_ 6791insA造成突變位點編碼酪氨酸的密碼子UAC→UAA（終止密碼子），導致蛋白質的翻譯提前終止，形成僅有2 264個氨基酸組成的截短多肽，影響蛋白質結構。NF1是常染色體顯性遺傳性疾病，由于負顯性效應機制導致患者患病。

NF1患者易患視神經膠質瘤和髓白血病，并可能出現認知功能障礙、血管畸形和骨骼畸形，NF1與多種組織和疾病的進展有關［11］。NF1異常增加了5倍的患惡性腫瘤的風險，有10%～13%NF1會發展為惡性外周神經鞘瘤［12］。本研究中先證者姐姐左外耳后神經纖維瘤手術切除后又復發，MRI顯示左側外耳軟組織浸潤性病變，不能排除惡變，因此需繼續隨訪。其兒子目前只是軀干和四肢有多處褐色斑，沒有皮膚結節。但由于經Sanger測序確定了其也存在NF1的c.6790_6791insA突變，因此可以預測到青春期，該患兒將會出現與先證者類似的皮膚結節臨床表現。

NF1基因龐大、外顯子多、缺乏明顯的突變熱點，在還沒有TNGS技術以前，國內外有一些文獻報道通過PCR擴增NF1基因全部外顯子，再逐一Sanger測序檢測突變，該方法較為繁瑣。近年來出現的TNGS通過芯片對目標基因編碼區及鄰近剪接區的DNA進行捕獲和富集，使用高通量測序平臺可對多外顯子基因和多種遺傳病的相關基因進行突變檢測。目前國內外已有少數文獻報道通過TNGS對NF1進行突變檢測［13-15］，顯示該方法具有高效、準確的優勢。本研究用TNGS準確地檢測出了患者的NF1突變位點。這一結果提示，該技術是NF1診斷的有效手段，值得在臨床應用。

國內對NF1患者進行基因檢測只有少量報道。臨床很少對NF1患者進行基因診斷的原因可能是因為其根據臨床表現易于診斷，但對患者做基因檢測有明顯的益處。NF1作為常染色體顯性遺傳性疾病，有50%的遺傳率。基因檢測不僅可以在基因水平明確病因，還可以為患者及其家系成員提供產前診斷的依據，為其提供生育無NF1健康孩子的機會。

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NF1 mutation detection and pedigree analysis in a patient with neurofibromatosis type 1

GUO Dandan1，LU Xinxin1，HUANG Xiaoli2，CHEN Xijun2，ZHANG Biao1，ZHENG Jiaying1，WU Yanan1，2★
（1.Provincial Clinical Medical College，Fujian Medical University，Fuzhou，Fujian，China，350004；2.Department of Clinical Laboratory，Fujian Provincial Hospital，Fuzhou，Fujian，China，350001）

［ABSTRACT］ObjectiveTo identify the genetic ecology in a patient with neurofibromatosis type 1 （NF1）.MethodsThe genomic DNA was extracted from peripheral blood of the proband and his family members.All coding exons and the flanking sequences of neurofibromin 1（NF1）from the proband were screened by targeted next-generation sequencing（TNGS），the suspected mutation was validated by Sanger sequencing.Finally，the same mutation site was detected in his family members by Sanger sequencing. ResultsA known pathogenic mutation c.6790_6791insA（p.Tyr2264Ter）was identified in the exon 45 of NF1 in the proband，his father and sister had similar clinical manifestations，but his mother and wife were asymptomatic.The same mutation was also detected in his 4-year-old son.ConclusionThe mutation ofc.6790_6791insA（p.Tyr2264Ter）is closely related to the pathogenesis of the NF1 family.

［KEY WORDS］Mutation detection；Neurofibromatosis type 1；NF1 gene；Targeted next-generation sequencing

作者單位：1.福建醫科大學省立臨床醫學院，福建，福州350004 2.福建省立醫院檢驗科，福建，福州350001