某國(guó)產(chǎn)NAT試劑盒應(yīng)用于血液篩查的評(píng)價(jià)與應(yīng)用

陳志忠　李結(jié)敏　廖揚(yáng)勛　梁劍鋒　余文潮　譚曉穎　梁麗婷　黃鉅明　陸倩文　陳尚良

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某國(guó)產(chǎn)NAT試劑盒應(yīng)用于血液篩查的評(píng)價(jià)與應(yīng)用

陳志忠李結(jié)敏廖揚(yáng)勛梁劍鋒余文潮譚曉穎梁麗婷黃鉅明陸倩文陳尚良★

［摘要］目的評(píng)估、驗(yàn)證某國(guó)產(chǎn)血液NAT試劑盒用于血液篩查的技術(shù)性能指標(biāo)。方法對(duì)某國(guó)產(chǎn)血液NAT試劑盒進(jìn)行了靈敏度、特異性、重復(fù)性、抗干擾能力和抗污染能力測(cè)試，并將其初步用于血液篩查。結(jié)果乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）RNA三者檢測(cè)靈敏度分別為不高于50 IU/mL、50 IU/mL與100 IU/mL；特異性、重復(fù)性、抗污染能力能滿足血站血液核酸檢測(cè)需求；混檢模式下，HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的檢出基本不受脂肪血顆粒的影響，但在單檢模式下會(huì)導(dǎo)致HIV RNA的漏檢，溶血對(duì)HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的檢出均有明顯干擾。結(jié)論某國(guó)產(chǎn)NAT檢測(cè)分析系統(tǒng)的靈敏度、特異性、重復(fù)性、抗污染能力等指標(biāo)均達(dá)《血站核酸檢測(cè)質(zhì)量控制指南》要求，脂肪血、溶血樣本能明顯干擾HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA的檢出能力。

［關(guān)鍵詞］血液篩查；核酸檢測(cè)；HBV DNA；HCV RNA；HIV RNA

★通訊作者：陳尚良，E-mail：fimmu2000@163.com

為避免經(jīng)輸血傳播疾病，各國(guó)采供血機(jī)構(gòu)都對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行了嚴(yán)格的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）病毒抗原或抗體檢測(cè)。但血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)存在“窗口期”、病毒變異、免疫沉默等造成的漏檢，血液的病毒安全性問題是全球關(guān)注的焦點(diǎn)問題［1］。為保障輸血安全，世界各國(guó)不斷開發(fā)和引進(jìn)新的血液篩查技術(shù)［2-5］。為了進(jìn)一步保障血液安全，我們國(guó)家提出了“十二五”期末實(shí)現(xiàn)血液核酸檢測(cè)全覆蓋的目標(biāo)。然而，進(jìn)口核酸檢測(cè)（nucleic acid test，NAT）試劑成本較高，綜合考慮國(guó)家政策導(dǎo)向和自身實(shí)際情況，我們對(duì)國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品—達(dá)安基因血液NAT試劑盒進(jìn)行了評(píng)估，并應(yīng)用于血液核酸檢測(cè)，現(xiàn)把研究報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

ChemagicSTAR核酸提取儀（HAMILTON，瑞士），ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Life Technologies，美國(guó)），核酸分離試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），核酸檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），外部質(zhì)控品（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）。

1.2靈敏度試驗(yàn)

按照廠家說明書要求，將外部質(zhì)控品分別稀釋至2倍檢測(cè)極限（limit of detection，LOD）、1倍LOD、0.5倍LOD，即濃度分別200 IU/mL、100 IU/ mL、50 IU/mL，單采用檢模式進(jìn)行3次檢測(cè)。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：1倍LOD處濃度應(yīng)100%檢出。

1.3特異性試驗(yàn)

將8份陰性質(zhì)控品混合至一個(gè)pool檢測(cè)；將8份陽(yáng)性質(zhì)控品混合至一個(gè)pool檢測(cè)，然后再進(jìn)行拆分檢測(cè)。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽(yáng)性樣品應(yīng)該全部檢出。

1.4重復(fù)性試驗(yàn)

將陽(yáng)性質(zhì)控品每次隨機(jī)進(jìn)行混樣檢測(cè)，共檢測(cè)8次；將陰性質(zhì)控品采用單檢模式進(jìn)行8管檢測(cè)。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽(yáng)性樣品應(yīng)該全部檢出。

1.5抗污染能力試驗(yàn)

將8份陰性血漿樣本和8份陽(yáng)性質(zhì)控品，按照一陰一陽(yáng)交叉排列，進(jìn)行檢測(cè)（單檢模式）。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽(yáng)性樣品應(yīng)該全部檢出。

1.6抗干擾能力試驗(yàn)

將陽(yáng)性質(zhì)控品（200 μL），添加至脂肪血或者溶血樣本（已確認(rèn)為陰性），制備為含相應(yīng)干擾物的陽(yáng)性樣本，再進(jìn)行檢測(cè)（單檢模式）。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽(yáng)性樣品應(yīng)該全部檢出。

1.7血液樣本NAT檢測(cè)

全血樣本進(jìn)行4項(xiàng)目［乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、HCV抗體（Anti-HCV）、HIV抗體（Anti-HIV）、梅毒抗體］2遍酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），全項(xiàng)陰性的樣本進(jìn)行NAT混樣檢測(cè)，呈反應(yīng)性的檢測(cè)pool再進(jìn)行拆分確認(rèn)試驗(yàn)，檢測(cè)流程參見圖1。

2　結(jié)果

2.1靈敏度試驗(yàn)

按照廠家說明書要求，將外部質(zhì)控品分別稀釋至2倍LOD、1倍LOD、0.5倍LOD，即濃度分別200 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL，進(jìn)行3次檢測(cè)（單檢模式），HBV DNA與HCV RNA在0.5倍LOD處均全部檢出，HIV RNA在1倍LOD處全部檢出，即HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者檢測(cè)靈敏度分別為50 IU/mL、50 IU/mL與100 IU/ mL，符合試劑說明書所描述的性能，滿足檢測(cè)要求，結(jié)果見表1。

2.2特異性試驗(yàn)

將8份陰性質(zhì)控品混合至一個(gè)pool檢測(cè)，結(jié)果顯示為陰性；將8份陽(yáng)性質(zhì)控品混合至一個(gè)pool檢測(cè)，結(jié)果顯示為陽(yáng)性，然后再進(jìn)行拆分檢測(cè)，8管全部為陽(yáng)性。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

將陽(yáng)性質(zhì)控品每次隨機(jī)進(jìn)行混樣檢測(cè)，共檢測(cè)8次，均為陽(yáng)性；將陰性質(zhì)控品采用單檢模式進(jìn)行8管檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

表1　NAT檢測(cè)分析系統(tǒng)靈敏度試驗(yàn)評(píng)價(jià)Table 1　The evaluation of sensitivity for NAT Kit

2.4抗污染能力試驗(yàn)

將8份陰性血漿樣本和8份陽(yáng)性質(zhì)控品按照一陰一陽(yáng)交叉排列，進(jìn)行檢測(cè)（單檢模式），陰性和陽(yáng)性樣本全部通過，交叉污染率為0。

2.5抗干擾能力試驗(yàn)

將陽(yáng)性質(zhì)控品（200 μL），添加至脂肪血或者溶血樣本（已確認(rèn)為陰性），制備為含相應(yīng)干擾物的陽(yáng)性樣本，再進(jìn)行檢測(cè)（單檢模式）。結(jié)果顯示脂肪血對(duì)混檢模式下HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的檢出均無影響，但在單檢模式下會(huì)導(dǎo)致HIV RNA的漏檢；溶血對(duì)HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的檢出均有明顯干擾，結(jié)果見表2。

表2　干擾能力試驗(yàn)Table 2　Interference ability test

2.6檢測(cè)拆分率與拆分陽(yáng)性率評(píng)估

試運(yùn)行至今，共檢測(cè)樣本462份，20批次檢測(cè)，其中pool陽(yáng)性2份，拆分陽(yáng)性2份，均為HBV DNA陽(yáng)性，拆分率和拆分陽(yáng)性率分別為10%和100%，經(jīng)過全項(xiàng)血液篩查（ELISA法）后，HBV DNA檢出率為2/462（約4‰），結(jié)果見表3。

表3　血液NAT檢測(cè)試運(yùn)行結(jié)果Table 3　Results of Blood NAT screen at first stage

3　討論

血液及血液制劑的病毒安全性一直是輸血安全的熱點(diǎn)問題［1，6］。至上世紀(jì)90年代，對(duì)輸血傳播疾病的篩查完全依賴于血清學(xué)試驗(yàn)，甚至今天，血清學(xué)篩查技術(shù)依然是血液篩查的重要手段。1998年德國(guó)紅十字獻(xiàn)血服務(wù)中心，將自己創(chuàng)建的NAT方法應(yīng)用于血液篩查，開啟了血液NAT新紀(jì)元。分子技術(shù)應(yīng)用于血液篩查，可將HBV、HCV和HIV感染的平均窗口期分別由56天、70天、22天縮短為41天、12天和11天，使輸血傳播相關(guān)病毒的風(fēng)險(xiǎn)降到最低，更大程度地保障血液安全［7］。國(guó)外對(duì)血液NAT檢測(cè)的研究較早，積累了較多經(jīng)驗(yàn)，技術(shù)也較成熟，但由于試劑成本較高等原因，一直難以在國(guó)內(nèi)全面推廣應(yīng)用［8-11］。為了貫徹實(shí)施國(guó)家衛(wèi)計(jì)委關(guān)于“十二五”實(shí)現(xiàn)血液核酸檢測(cè)全覆蓋的目標(biāo)以及響應(yīng)國(guó)家關(guān)于大型醫(yī)療裝備優(yōu)先采購(gòu)國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品的號(hào)召，我們對(duì)某國(guó)產(chǎn)品牌的血液NAT試劑盒進(jìn)行技術(shù)評(píng)價(jià)，并將其初步用于我站的血液篩查。

該國(guó)產(chǎn)品牌血液NAT試劑盒，采用混合8人份樣本進(jìn)行核酸提取，然后分別進(jìn)行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 3項(xiàng)擴(kuò)增，最后通過實(shí)時(shí)讀取數(shù)據(jù)判斷是否具有反應(yīng)性；反應(yīng)性的pools再進(jìn)行拆分確認(rèn)試驗(yàn)。為了驗(yàn)證試劑盒的檢出靈敏度，我們采用外部質(zhì)控品對(duì)試劑盒進(jìn)行靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA檢測(cè)靈敏度分別為不高于50 IU/mL、50 IU/mL與100 IU/mL，均能達(dá)到國(guó)家相關(guān)要求。然而，與國(guó)際知名品牌相比，國(guó)產(chǎn)的試劑盒的靈敏度尚存在改進(jìn)空間。例如Roche的MPX檢測(cè)系統(tǒng)、Novarits的Tigris Ultrio Plus系統(tǒng)其HIV最低檢測(cè)限能達(dá)到不高于50 IU/mL，HBV、HCV的最低檢出限更是達(dá)到了不高于10 IU/mL的高靈敏度。

為了評(píng)估該國(guó)產(chǎn)品牌血液NAT檢測(cè)系統(tǒng)的抗污染能力，我們模擬日常工作，將強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品按照一陰一陽(yáng)交叉排列，采用單檢模式進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)展檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果顯示本檢測(cè)系統(tǒng)的抗污染能力滿足要求，只要操作規(guī)范，陽(yáng)性樣本不會(huì)造成交叉污染導(dǎo)致樣品間或者實(shí)驗(yàn)室污染。同時(shí)為了考察檢測(cè)系統(tǒng)的特異性，我們按前述樣本的排序，分別采用混檢和單檢模式進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)展檢測(cè)試驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與預(yù)期相符合，顯示了較好的特異性。

樣本的質(zhì)量是檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵保證。在臨床檢測(cè)中，可以通過對(duì)患者下醫(yī)囑等措施，實(shí)施樣本采集前的質(zhì)量控制，而且不合符質(zhì)量控制要求的樣本，可以重新進(jìn)行樣本采集。相比之下，無償獻(xiàn)血行為大多為自發(fā)性行為，樣本采集難以做到很好的采集前質(zhì)量控制；同時(shí)考慮到血液制劑樣本朔源性等問題，對(duì)于脂肪血顆粒較多等不符合NAT檢測(cè)要求的樣本，也不可能仿效臨床檢測(cè)進(jìn)行重新采樣。因此，我們對(duì)血液篩查樣本中最常見的脂肪顆粒、輕度溶血等不合符要求的樣本進(jìn)行抗干擾試驗(yàn)。我們的測(cè)試結(jié)果顯示：混檢模式下，HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的檢出基本不受脂肪血顆粒的影響，但在單檢模式下會(huì)導(dǎo)致HIV RNA的漏檢；溶血對(duì)HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的檢出均有明顯干擾。基于上述結(jié)果以及血液檢測(cè)工作的特點(diǎn)，提示我們?cè)趯?shí)際工作中，應(yīng)該盡量避免溶血樣本，對(duì)于難以避免的脂肪血樣本，應(yīng)該評(píng)估脂肪顆粒的嚴(yán)重程度，謹(jǐn)慎對(duì)待其核酸檢測(cè)陰性結(jié)果。

通過前述的技術(shù)指標(biāo)評(píng)估，我們認(rèn)為該國(guó)產(chǎn)品牌血液NAT試劑盒能滿足我們對(duì)血液篩查的技術(shù)要求，因此試將其用于我站的血液篩查。參考兄弟單位的做法以及廠家的推薦意見，我們初步擬定按照?qǐng)D1的流程進(jìn)行篩查。試運(yùn)行期間，共檢測(cè)樣本462份，20批次檢測(cè)，其中pool陽(yáng)性2份，拆分陽(yáng)性2份，拆分率和拆分陽(yáng)性率分別為10%和 100%。2份陽(yáng)性樣本均為HBV DNA陽(yáng)性，為了進(jìn)一步確認(rèn)獻(xiàn)血者感染狀況，我們追蹤獻(xiàn)血者重新采樣進(jìn)行檢測(cè)，但由于各種原因，僅成功召回1號(hào)獻(xiàn)血者，采用HBV DNA定量檢測(cè)系統(tǒng)，能檢測(cè)到其體內(nèi)存在低拷貝HBV DNA，同時(shí)其e抗原也為陽(yáng)性，定義為隱匿性HBV感染（occult HBV infection，OBI）感染。以已經(jīng)確認(rèn)的數(shù)據(jù)來計(jì)算，經(jīng)過ELISA過篩后，我們的HBV DNA檢出率為1/462；如果以2例陽(yáng)性來計(jì)算，HBV DNA檢出率為2/462，與國(guó)內(nèi)報(bào)道大體相近［12-16］，但遠(yuǎn)高于國(guó)外的參與風(fēng)險(xiǎn)［17］。當(dāng)然，我們?cè)囘\(yùn)行期間所取得的數(shù)據(jù)為小樣本，更多的檢測(cè)效能驗(yàn)證有待后續(xù)開展，但毫無置疑的是，應(yīng)用該國(guó)產(chǎn)品牌NAT試劑于血液篩查，將進(jìn)一步提升血液安全特別是HBV病毒性安全。

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·綜述·

Evaluation and application of a domestic NAT kit used for blood screening

CHEN Zhizhong，LI Jiemin，LIAO Yangxun，LIANG Jianfeng，YU Wenchao，TANG Xiaoying，LIANG Liting，HUANG Juming，LU Qianwen，CHEN Shangliang★
（Zhaoqing Blood Center，Zhaoqing，Guangdong，China，526020）

［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the capability of a domestic blood screening NAT kit. MethodsThe sensitivity，specificity，repeatability，anti-interference ability，and anti-pollution ability of the kit were analyzed.ResultsThe sensitivity of HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA detection were not more than 50 IU/mL，50 IU/mL and 100 IU/mL respectively，and specificity，repeatability，anti-pollution ability met the demands for blood nucleic acid test.There was no interference due to fat particles in the analyses of HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA in mini pool of 8 samples model，but HIV RNA was not detected in ID-NAT model due to fat particles.The detection of those 3 marks was interfered with by hemolysis. ConclusionsThe sensitivity，specificity，repeatability，anti-interference ability and anti-pollution ability of the kit could meet the demands for blood screen，but the interference from fat particles or hemolysis is a concern for the detection capability for HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA.

［KEY WORDS］Blood screening；Nucleic acid test；HBV DNA；HCV RNA；HIV RNA

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（A2015238）；肇慶市科技創(chuàng)新計(jì)劃（2014E1814）

作者單位：肇慶市中心血站，廣東，肇慶526020