EB病毒感染的核酸檢測：標本類型的選擇

郭建巍

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·述評·

EB病毒感染的核酸檢測：標本類型的選擇

郭建巍★

［摘要］近年來的研究表明，EB病毒（epstein-barr virus，EBV）感染與多種疾病的發生有密切的關系。由于EB病毒獨特的感染方式，其實驗室診斷特別是核酸檢測顯得尤為重要。本文就EB病毒的生物學特性、感染方式、抗體產生，特別是核酸檢測中標本類型的選擇、標準化以及未來的檢測方向等問題進行了述評和展望，以期為EB病毒感染相關疾病的診斷和預后評判提供更準確的核酸檢測結果。

［關鍵詞］EB病毒；標本；血漿；外周血單個核細胞

★通訊作者：郭建巍，E-mail：jwkuo@sohu.com

EB病毒（epstein-barr virus，EBV）即人類皰疹病毒Ⅳ型（human herpesvirus type 4），是一種常見的人類皰疹病毒。EBV初次感染后就終生定居在B細胞中。據文獻報道，約90%以上的成人EB病毒血清學反應陽性，提示在兒童或青少年時感染過EB病毒［1］。

近年來大量研究證明，EBV與人群鼻咽癌、何杰金病、T/NK細胞淋巴瘤（T/Natural killer cell lymphoma）、Burkitt淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma）、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤發生、發展相關，還與免疫抑制劑使用患者和多種免疫缺陷性疾病患者移植后淋巴細胞增殖性異常（post-transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）、移植后平滑肌腫瘤、獲得性免疫缺陷綜合癥（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）相關性淋巴瘤、多發性硬化、原發性中樞神經系統淋巴瘤或平滑肌肉瘤密切相關［2-7］。由于EBV廣泛的疾病譜，EBV已成為許多學者研究和關注的焦點。

在EBV感染的臨床診斷中，臨床醫生必須要弄清楚幾個問題：患者是否感染EBV？EBV感染處于什么時相？是否為EBV的活動性感染？所患疾病是否與EBV感染相關？只有弄清楚了這幾個問題，才能對EBV相關疾病的診療有一個全面而整體的認識，才好有的放矢、對癥治療。而要回答這些問題，就必須要了解EBV的生物學特性及其特殊的感染形式。本文就EBV生物學特性及感染方式、EBV感染類型及免疫相關指標、感染后的實驗診斷指標、核酸檢測標本類型的選擇、標準化等問題進行討論，以期為EBV感染相關疾病的診斷和預后評判提供科學依據（表1）［8］。

表1　EBV相關性疾病核酸檢測建議使用的標本類型［8］Table 1　Suitable type of specimens preferred in nucleic acid detections in different epstein-barr virus-associated diseases［8］

1　EBV生物學特性及感染方式

EBV是線性雙鏈嗜B細胞DNA病毒，基因組長172 kb，包括編碼衣殼抗原（viral capsid antigen，VCA）、早期抗原（early antigen，EA）和核抗原（nuclear antigen，NA）的基因。EBV基因組大部分是相同的，在編碼EBV核抗原（EBV nuclear antigen，EBNA）2，EBNA 3A，EBNA 3B及EBNA 3C的基因亞型中存在一些等位基因多態性的亞型，Ⅰ型在西方國家和東南亞居多，非洲地區Ⅰ型和Ⅱ型同時存在。

人是EBV感染的惟一宿主，由于B細胞表面有EBV受體分化群抗原21（cluster of differentiation antigen，CD21）分子，EBV能直接感染侵入B細胞并使其永生化，或以郎罕氏細胞介導的方式感染口咽部上皮細胞，入血后再感染B淋巴細胞。由于絕大多數上皮細胞缺少CD21分子，EBV侵入上皮細胞的機制要比侵入B細胞復雜。一般認為EBV原發性感染發生在口腔，口咽部上皮細胞和B細胞為EBV主要宿主細胞，EBV也可感染T細胞、NK細胞、平滑肌細胞和濾泡樹突狀細胞等。根據EBV感染時間和EBV感染后產生的特異性抗體譜，可將EBV的感染分為原發感染、潛伏和激活3種類型。

EBV通過病毒包膜糖蛋白gp350與B細胞表面CD21分子結合，接著EBV gp42與B細胞上人白細胞抗原Ⅱ類分子（human leucocyte antigenⅡ，HLA-Ⅱ）結合而促進膜融合，EBV進入B細胞并擴增，表達病毒特異性抗原分子，誘導機體免疫應答，活化NK細胞，誘導產生EBV特異性細胞毒T細胞（EBV-specific cytotoxic T lymphocytes，CTL），抑制并最終清除EBV陽性B細胞。EBV原發感染消退快，僅于部分記憶性B細胞內建立持續甚至終身性潛伏，因此傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）［9］一般呈良性自限性，IM發病過程是機體免疫控制EBV的結果。急性感染痊愈后的個體內有百萬分之一的B細胞會攜帶有EBV基因組，這也是EBV感染的一個重要特性。

2　EBV感染類型及免疫相關指標

EBV原發感染后，體內首先出現EBV衣殼抗原特異性 IgM 抗體（viral capsid antigen IgM antibody，VCA-IgM），隨后出現EBV衣殼抗原特異性IgG抗體（viral capsid antigen IgM antibody，VCA-IgG），急性感染的晚期出現抗早期抗原（early angtigen，EA）抗體，而EBNA IgG抗體陰性。

在潛伏期，多數細胞中的EBV基因組處于潛伏狀態，此時細胞只合成EBNA、EB病毒編碼的小RNA（EBV encoded small RNA，EBER）和潛伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP），包括EBNA 1-2，EBNA 3A-3C，EBER1，EBER2，LMP1及LMP2A。處于潛伏期的EBV并不復制，絕大多數存在于記憶性B細胞上，被感染的記憶性B細胞進入外周血循環時血中可檢測到病毒。目前認為有5種EBV感染類型，即溶解型、0型、Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。不同的感染類型與不同的臨床疾病密切相關。在溶解型中，被感染的細胞為淋巴組織中的漿細胞，漿細胞被感染后，EBV在漿細胞中復制，表達溶解基因，導致EBV復活，最后導致細胞的溶解；0型指EBV感染處于潛伏狀態，被感染的細胞為外周血記憶細胞，處于0型感染的EBV在患者體內終生存在，此型感染屬于EBV健康攜帶者；在Ⅰ型潛伏感染中，被感染的細胞為外周血記憶細胞，主要見于Burkitt淋巴瘤細胞，EBNA只表達EBNA1基因；在Ⅱ型潛伏感染中，被感染的細胞為淋巴組織中的生發中心細胞，Ⅱ型潛伏感染與鼻咽癌、NK細胞淋巴瘤和何杰金病有關，此時病毒處于沉默期，被感染細胞中出現EBNA1及LMP1/2A等病毒產物；在Ⅲ型潛伏感染中，被感染細胞為淋巴組織中的幼稚細胞，表達EBNA1，EBNA2，EBNA3A-C，EBNA-LP，LMP1，LMP2A+B等基因，活化B細胞，在急性傳染性單核細胞增多或移植后淋巴細胞增生性異常患者中可觀察到Ⅲ型潛伏感染。

EBV原發感染4～6個月后體內檢測到的抗體主要為IgG型抗體，代表性抗體為VCA-IgG和EBNA-IgG［10］，EBV既往感染表明曾經發生EBV感染，但目前無活動性EBV感染的臨床表現和實驗室證據。免疫功能正常，EBNA-IgG抗體陽性者如EA抗體滴度顯著高，一般表明存在EBV感染激活或再燃。EBV原發感染后，部分感染者特異性EA抗體可能持續數年而并無臨床癥狀，因此，是否存在活動性EBV感染相關臨床表現也是診斷EBV感染激活的重要依據。此時如果動態檢測血液中的EBV核酸將對疾病的診斷及轉歸判斷提供重要依據。

3　EBV感染后的實驗診斷指標

可以說機體的免疫功能狀況是決定EBV潛伏感染狀態和EBV相關疾病發生乃至發展的重要因素。被感染的B細胞偶爾會受到刺激而重新激活，激活的病毒可再感染新的B細胞和上皮細胞，使處于潛伏狀態下的EBV再次激活并大量復制，導致IM癥狀持續存在或退而復現稱為慢性活動性EBV感染（chronic active EBV infection，CAEBV）。EBV感染T/NK細胞并造成其克隆性增生且不能產生足夠的CTL可能是其發病的主要原因。目前對病毒再激活的分子機制目前仍無清晰的認識。深入了解每種基因產物在EBV相關疾病發病中作用會幫助臨床醫生制定出更多合理、有效的預防及治療策略。

目前常用的用于EBV感染的實驗室指標有嗜異性抗體檢測、血液細胞分析即血常規、異型淋巴細胞分型、EBV特異性抗體檢測及分型、EB病毒核酸定量和EBER原位雜交。EBER已成為組織和細胞中EBV檢測的金標準，并廣泛應用于臨床病理學診斷。熒光定量PCR（fluorescent quantita-tive polymerase chain reaction，FQ-PCR）可用于定量檢測體液及組織樣本中的EBV拷貝數，特別適用于移植病人EBV相關疾病的感染監測；通過檢測腦脊髓液中的EBV核酸可診斷中樞神經系統是否有EBV感染；對非典型臨床癥狀患者或嗜異凝集試驗陰性的IM幼兒通過EBV核酸定量可做出實驗室診斷；通過EBV核酸定量可評價抗EBV治療的療效；檢測血漿中EBV核酸水平對鼻咽癌的的診斷、轉移、復發和預后判斷均有重要意義［10］。

4　EBV核酸檢測標本類型的選擇

關于血液中EBV檢測標本類型的選擇有許多爭議，其焦點來源于EBV在血漿中拷貝數比在全血樣本中的拷貝數低10～100倍，因此多數人還是傾向于全血。近年來，熒光定量PCR已廣泛應用于EBV感染的實驗室診斷［11］，也是EBV核酸定量的金標準，目前至少有10種不同的熒光定量PCR商用試劑在中國、美國和歐洲等國家和地區使用［12］，除在鼻咽癌的診斷中EBV DNA有一定的缺陷外，在其他感染性疾病的診斷中均發揮了重要的作用。

一般來說，外周血中的EBV DNA可以溶解的線型或游離循環DNA形式出現，線型的DNA在EBV重新活化、伴隨著宿主細胞溶解和產生病毒體時均可在血液中檢測到，游離的DNA在潛伏感染的B細胞中也可檢測到。此外，凋亡的腫瘤細胞釋放的裸露的無細胞EBV DNA也可在外周血中檢測到。在EBV重新激活時釋放病毒，此時要檢測血清或血漿，因為其包含與細胞無關的DNA，如果要檢測全血中與細胞相關DNA的話要選擇外周血單個核細胞或B細胞作為首選標本。

關于在熒光定量PCR檢測中如何選擇合適的標本，表1根據不同疾病列出了EBV核酸定量中可供臨床選擇的適宜標本類型［8］。表中對各類疾病中最合適的標本類型進行了推薦，但由于EBV的特殊性，在EBV相關疾病的檢測中標本選擇目前仍不能做到唯一和絕對。通常情況下，外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中的EBV載量檢測更加精確，因為它是B細胞的在血液中停留的重要地方。對移植患者，檢測全血中EBV的核酸定量與PBMC中核酸定量同樣有效，這樣就可以避免了核酸定量檢測中由于提取PBMC產生的花費與更長等待時間。也許這個模式也可用于其它EBV相關疾病的核酸檢測中，如鼻咽癌、T/NK細胞淋巴瘤、何杰金病、B細胞非何杰金淋巴瘤（B cell non-hodgkin lymphomas，B-NHL），因為這些疾病中病毒并不能從凋亡的腫瘤細胞中釋放出來，而這些疾病目前還推薦用血漿進行EBV核酸的定量檢測。對移植相關疾病，EBV的核酸定量顯得非常必要，為提高檢測的敏感性和特異性，對PTLD病人還要結合EBV特異性細胞免疫來進行綜合判斷［13-15］，這對區別PTLD復發和區分EBV感染后的慢性高病毒載量（chronic high viral loads，CHVL）具有重要意義。目前的臨床實踐中我們更傾向于使用PBMC和血漿中的EBV核酸定量結果來指導臨床診療［16］，從這2種類型標本的檢測結果還可以推算出全血中的EBV濃度，因此具有更高的實用價值。

5　EBV核酸檢測的標準化

在熒光定量PCR檢測EBV核酸定量中，還有一個亟待解決的重要問題就是定量的標準化。目前評估病毒載量的單位有全血和血漿中copies/ mL、DNA中copies/μg和copies/每個細胞，國內大多數實驗室用全血和血漿中IU/mL、copies/mL來表示。如果統一使用國際單位及標準，就可使實驗室內部的比較更加有效，疾病的診斷、預后判斷及預先治療就有了統一的標準。雖然有許多學者在這方面做了大量工作，并成立了專門的國際組織，但由于不同的廠家使用的EBV靶序列區域不同、引物和探針不同，導致擴增的效率也不同；此外，不同EBV基因組中重復序列不同，不同EBV相關疾病中EBV表達方式也不同，因此EBV核酸定量的標準化仍有一定的難度［17］。為了保證精確的定量，有學者推薦在核酸定量中設計引物和探針時，要使用EBV中的單個高度保守區域，不建議使用BamHI-W區域，如EBNA1和BALF-5基因的BamHI-K區域［18］。從2015年開始衛生部臨床檢驗中心增加了巨細胞病毒核酸檢測的室間質評工作，明確以IU/mL作為結果的表示方法。提示衛生部臨床檢驗中心對國內臨床實驗室EBV核酸檢測的質量控制及標準化監管指日可待。

6　EBV核酸檢測的展望

未來EBV的核酸定量中將會增加數字PCR技術［19］。數字PCR通過計數單個分子從而實現絕對定量，它采用直接計數目標分子數而不依靠任何校準物及內標與外標，更容易實現檢測中的質量控制和標準化。數字PCR在進行擴增反應前，將含有DNA模板的PCR溶液稀釋后分布到獨立反應室，在微流控芯片上單分子間通過稀釋分離，獨自進行PCR擴增，最后分析每個擴增產物。數字PCR操作方便、特異性強、靈敏度高、檢測通量高，已成為分子生物學研究中的重要手段。與傳統熒光定量PCR相比，除檢測范圍較窄的缺點外，數字PCR更加精確，可以檢測更低拷貝數的目標DNA分子，同時還可以研究基因序列的變化，可為下一代測序定向克隆擴增出樣本中的DNA分子，并實現病毒分子的絕對定量。在EBV的核酸檢測中如果將數字PCR技術和熒光定量PCR技術配合使用，可以揚長避短，必將為EBV相關疾病的臨床診斷提供更加準確和可靠的實驗室結果。

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What kind of specimen is used for epstein-barr virus nucleic acid detection

GUO Jianwei★
（Clinical Laboratory，Navy General Hospital，Beijing，China，100048）

［ABSTRACT］In recent years，many researchers have demonstrated that epstein-barr virus（EBV）infections are associated with a broad spectrum of diseases.Due to the unique mode of infection by EBV，nucleic acid detection appears to be particularly important.In this review article，the biological characteristics，infection modes，and production of antibodies of epstein-barr virus will be discussed，as well as the suitable type of specimens，standardization and future development direction of nucleic acid detection methods in an effort to supply more accurate results for diagnosis and prognostic evaluation of EBV-associated diseases.

［KEY WORDS］Epstein-barr virus；Specimen；Plasma；Peripheral blood mononuclear cells

作者單位：海軍總醫院檢驗科，北京100048