CAMP/PKA通路在結直腸癌肝轉移中的作用及機制研究

錢晶蔣學通徐傳奇王道榮

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CAMP/PKA通路在結直腸癌肝轉移中的作用及機制研究

錢晶1蔣學通2徐傳奇2王道榮2

【摘要】目的 構建小鼠結直腸癌肝轉移模型，探討CAMP/PKA通路在結直腸癌肝轉移中的作用機制。方法 采用皮下成瘤盲腸部位包埋的方法，建立結直腸癌肝轉移小鼠模型，隨機分為實驗組及對照組。實驗組模型小鼠連續7天注射CAMP類似物，并于注射完成后7天、14天、28天處死小鼠，采用免疫組化的方法檢測兩組小鼠原發灶及轉移灶內CAMP、PKA、VEGF的表達，采用實時定量PCR的方法檢測正常組織及癌組織內MMP2、E-鈣粘蛋白的表達。結果 成功建立結直腸癌肝轉移小鼠模型，實驗組較同期對照組原發灶變小，腹腔及肝臟轉移瘤少。兩組中轉移灶VEGF的表達高于原發灶，癌組織中E-鈣粘蛋白表達低于正常組織，MMP2高于正常組織。實驗組中隨著藥物作用時間延長，CAMP、PKA、VEGF、MMP2的表達逐漸變弱。E-鈣粘蛋白的表達逐漸升高。結論 CAMP/PKA可通過調節VEGF、E-鈣粘蛋白、MMP2的表達，促進結直腸癌發生肝臟轉移。

【關鍵詞】結直腸腫瘤； 新生血管化，病理性； CAMP/PKA； 上皮間質轉化

結直腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年升高。肝臟轉移是影響結直腸癌患者預后的主要因素，大約有20％～25％的結直腸癌患者確診時已發生肝臟轉移，即使行原發灶腫瘤切除術后，仍有30％可發生異時性肝臟轉移。目前結直腸肝臟轉移的機制仍不明確，多項研究證實血管生成及上皮間質轉化在結直腸癌肝轉移中的作用至關重要［1-2］。

CAMP/PKA通路是一條經典的G蛋白偶聯的細胞信號傳導途徑，參與多項細胞生理活動。而有研究證實CAMP/PKA參與VEGF的分泌及表達［3］，但其在結直腸癌肝轉移中的作用未被研究，我們通過構建結直腸癌肝轉移的小鼠模型，研究CAMP/PKA通路在結直腸癌肝轉移中的作用，并對其機制初步探討。

資料與方法

一、一般資料

SPF級4～6周齡的Bal b/c雄性小鼠，體重20～26克，夠買并飼養于揚州大學比較醫學中心；CT26細胞購于中國科學院，CAMP、PKA、VEGF蛋白單克隆抗體購于美國Santa Cruze生物公司，工作濃度為1：50；SP試劑盒購于福州邁新生物技術公司。PCR試劑盒購于Takala公司。

二、模型建立

CT26細胞培養于1640培養基，通過細胞傳代，胰酶消化、吹打，制備CT26細胞株細胞懸液，于大鼠腋下注射，細胞注射量為1×107/200 μl，10 d左右長出直徑1 cm的腫塊，少量組織性HE染色。按照300 g/1.0 ml水合氯醛的給藥劑量，給大鼠麻醉，縱向切開左下腹皮膚約2 cm，將大鼠的盲腸拖出至皮下，將腫瘤塊縫合于腸組織上，縫合皮膚。

三、實驗分組與干預

將模型小鼠分為實驗組和對照組兩組，實驗組予以8-溴-cAMP 60 mg/kg/d的劑量腹腔注射連續7 d，分別于第7 d，14 d，28 d處死小鼠，檢測相關指標。對照組無特殊處理，同期處死對照組小鼠，檢測相關指標。

四、觀察的指標與檢測方法

1.皮下移植瘤形成情況，通過HE染色證實為腫瘤形成；2.盲腸原位包埋腫瘤后，腹腔內轉移瘤形成情況，包括肝臟轉移，腹腔轉移及大小；3.免疫組織化學檢測組織內CAMP、PKA、VEGF表達，PCR方法檢測實驗組和對照組原發灶及轉移灶中MMP2及E-鈣粘蛋白的表達。

五、統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為顯著性檢驗。

結 果

一、模型建立情況

小鼠于皮下注射腫瘤細胞，最早5天形成轉移瘤，10天左右生長出皮下瘤可形成約1 cm腫塊。盲腸部位的包埋皮下瘤的方法，成功建立結直腸癌肝轉移模型。見圖1。

二、原發灶與轉移灶生長情況

隨著時間推移，實驗組及對照組均表現為原發灶的生長，腹腔內及肝臟轉移瘤的形成，但實驗組原發灶生長更加緩慢，相同腹腔內及肝臟內轉移腫瘤數目少、體積小。具體見表1。

圖1 結直腸癌肝轉移模型

三、CAMP、PKA、VEGF表達情況

實驗組及對照組中肝轉移灶中VEGF表達較原發灶升高。實驗組中CAMP的表達隨著用藥時間的延長，表達量逐漸減少、且PKA、VEGF表達也呈現逐漸下降趨勢。見圖2。

四、MMP2及E-鈣粘蛋白的表達

（一）MMP2的表達

實驗組及對照組中MMP2表達均較正常組織升高，但實驗組中原發灶MMP2表達較對照組下降，且隨著藥物作用時間的延長，實驗組原發灶MMP2的表達逐漸下降。見圖3。

表1 不同時期原發灶大小及轉移瘤數目表

注：**表示兩者之間有統計學意義（P＜0.05）圖3 實驗組及不同時間段對照組中MMP2表達

（二）E-鈣粘蛋白的表達

實驗組及對照組的原發灶中E-鈣粘蛋白的表達較正常組織下降，但實驗組原發灶中較對照組中表達上升，且隨著藥物作用時間延長，E-鈣粘蛋白的表達呈現逐漸升高的趨勢。見圖4。

討 論

CAMP/PKA通路是一條經典的由G蛋白偶聯受體介導的細胞信號傳導通路，外界信號分子刺激膜體后，激活細胞內的腺苷酸環化酶，導致細胞內CAMP水平升高，從而激活PKA，產生一系列的生物學反應。目前已證實，其參與細胞的增殖、分化及凋亡、離子轉運、調節新陳代謝、基因轉錄相關［4］。PKA作為CAMP的下游分子，由催化亞基及調節亞基構成，催化亞基可介導多種底物蛋白的磷酸化，而調節亞基的兩種亞型RⅠ與RⅡ則主要參與細胞的增殖與分化。一旦外界因素導致細胞內RⅠ型亞基優勢表達，導致細胞的無限的增殖，腫瘤形成。

注：**表示兩者之間有統計學意義（P＜0.05）圖4 實驗組及不同時間段對照組的原發灶中E-鈣粘蛋白的表達

血管生成及上皮間質轉化的形成是腫瘤發生侵襲轉移的兩種重要的途徑。VEGF是誘導血管形成的重要的因子，在腫瘤的血管生成及侵襲轉移中有重要的作用，有研究證實VEGF的表達與CAMP的激活相關。在皮下海綿移植的小鼠模型中，激活cAMP的合成能促進血管內皮細胞分泌VEGF，從而促進腫瘤血管的形成［5］。Namkoong等［3］發現腺苷酸環化酶激動劑能促進人血管內皮細胞分泌VEGF從而促進血管形成。E-鈣粘蛋白及MMP2是介導上皮間質轉化的重要的因子，有研究表明，在子宮肌瘤中CAMP/PKA通路的激活能夠調節腫瘤細胞MMP2的表達［6］。E-鈣粘蛋白是上皮細胞的連接分子，在上皮細胞發生腫瘤及間質轉化的過程中，其表達常常會下降［7］。CAMP/PKA通路在上皮間質轉化的作用及對E-鈣粘蛋白表達的影響仍未被研究證實。

本研究通過使用CAMP的類似物（8-溴-CAMP）干預結直腸癌肝轉移小鼠模型，分別在在藥物處理后7天、14天、28天處死小鼠。從實驗結果分析，8-溴-CAMP能夠抑制小鼠產生肝臟轉移及腹腔轉移，同時試驗組發生肝臟轉移的數目及大小都較對照組減少，說明CAMP/PKA通路在結直腸癌侵襲轉移尤其是肝轉移起作用。檢測原發灶及轉移灶中的CAMP、PKA、VEGF的表達，發現原發灶及肝轉移灶中VEGF的表達差異，說明VEGF在結直腸肝轉移中起到重要的作用。隨著用藥時間的延長，VEGF的表達逐漸下降，與CAMP及PKA的表達呈一致性，推測CAMP/PKA通路能夠通過調節VEGF的表達促進結直腸癌的肝臟轉移。

圖2 CAMP、PKA、VEGF的表達

利用PCR技術檢測實驗組及對照組中腫瘤組織與正常組織中E-鈣粘蛋白及MMP2，其中E-鈣粘蛋白在癌組織中的表達是低于正常組織，且隨著藥物作用時間的延長，E-鈣粘蛋白的表達逐漸增高，推測在腫瘤組織內的CAMP/PKA的激活可抑制E-鈣粘蛋白的表達，導致腫瘤侵襲能力增加，發生遠處轉移。MMP2也是上皮間質轉化中的經典分子，本研究實驗結果顯示癌組織內表達要高于正常組織，且隨著用藥時間的延長，MMP2在癌組織內的表達呈下降趨勢，且隨著MMP2表達的下降，肝臟轉移數目逐漸減少。推測CAMP/PKA激活可促進癌組織內MMP2的表達，促進結直腸癌發生肝轉移。

本研究結果顯示：CAMP/PKA通路促進VEGF的表達參與腫瘤新生血管生成促進結直腸癌發生肝轉移，同時促進MMP2的表達和抑制E-鈣粘蛋白的表達，促進上皮間質轉化的形成，導致結直腸癌發生肝轉移。

參 考 文 獻

［ 1 ］ Roger L， Jullien L， Gire V， et al. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells ［J］. J Cell Sci， 2010， 123（Pt 8）： 1295-1305.

［ 2 ］ van der Wal GE， Gouw AS， Kamps JA， et al. Angiogenesis in synchronous and metachronous colorectal liver metastases： the liver as a permissive soil ［J］. Ann Surg， 2012， 255（1）： 86-94.

［ 3 ］ Namkoong S， Kim CK， Cho YL， et al. Forskolin increases angiogenesis through the coordinated cross-talk of PKA-dependent VEGF expression and Epac-mediated PI3K/Akt/eNOS signaling ［J］. Cell Signal， 2009， 21（6）： 906-915.

［ 4 ］ 任偉宏.蛋白激酶與細胞凋亡信號及凋亡抑制信號的轉導［J］.國外醫學： 臨床生物化學與檢驗學分冊， 2004， 25（1）： 79-82.

［ 5 ］ Amano H， Ando K， Minamida S， et al. Adenylate cyclase/protein kinase A signaling pathway enhances angiogenesis through induction of vascular endothelial growth factor in vivo ［J］. Jpn J Pharmacol，2001， 87（3）： 181-188.

［ 6 ］ 劉玨， 申清香， 李興， 等.來曲唑通過cAMP-PKA信號通路影響子宮肌瘤細胞中MMP-2和TIMP-2的表達［J］.中國現代醫生，2013， 51（16）： 4-7.

［ 7 ］ Christofori G， Semb H. The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumour-suppressor gene ［J］. Trends Biochem Sci，1999， 24（2）： 73-76.

（本文編輯：楊明）

錢晶， 蔣學通， 徐傳奇， 等. CAMP/PKA通路在結直腸癌肝轉移中的作用及機制研究［J/CD］. 中華結直腸疾病電子雜志，2016， 5（3）： 244-248.

The effect and mechanism of CAMP/PKA pathway in colorectal liver metastases

Qian Jing1， JiangXuetong2， Xu Chuanqi2， Wang Daorong2.1Department of General Surgery， Medicine School of Yangzhou University， Yizheng Hospital of Nanjing Gulou Hospital Group， Yangzhou 225001， China；2Gastrointestinal Centre， Clinical Medical College of Yangzhou University， Subei People?s Hospital，Yang zhou 225001， China Corresponding author: Wang Daorong， Email: daorong666@sina.com

【Abstract】Objective To establish a mouse model of colorectal liver metastasis，and to explore the mechanism of CAMP/PKA pathway in colorectal liver metastasis. Methods To establish a mouse model of colorectal liver metastasis by embedding subcutaneous tumor in the appendix， and randomly divided into experimental group and control group. The mice of experimental group were injected CAMP analogs for 7 days， the mice were sacrificed in 7 days， 14 days， and 28 days after injection. The expression of CAMP，PKA and VEGF in two groups were detected by immunohistochemical method. The expression of MMP2 and E-cadherin in normal tissue and cancer tissue were detected by quantitative PCR. Results It was succeed to establish a mouse model of colorectal liver metastasis. Comparing to control group， the number of liver metastasis and volume of primary tumor were small in experimental group. The expression of VEGF in the two groups was higher than that in the primary tumor. The expression of E-cadherin in the cancer tissues was lower than that in the normal tissues， and MMP2 was higher than that in the normal tissues. In the experimental group， the expression of CAMP、PKA、VEGF、MMP2 were gradually decreased， while the expression of E-cadherin was increased gradually. Conclusion CAMP/PKA promoted colorectal liver metastasis by regulating the expression of VEGF， E-cadherin and MMP2.

【Key words】Colorectal neoplasms； Neovascularization， pathologic； CAMP/PKA； Epithelial mesenchymal transition

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.03.010

作者單位：225001 揚州大學醫學院，南京鼓樓醫院集團儀征醫院普外科1；225001 揚州大學臨床醫學院蘇北人民醫院胃腸中心2

通訊作者：王道榮，Email：daorong666@sina.com

收稿日期：（2016-04-02）