黃邦榮，展　銳，倪　紅，楊佳華，王蘭英，張永萍，梁　曦

(甘肅省中醫(yī)院腫瘤血液科，甘肅 蘭州 730050)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

蘭州方對(duì)再生障礙性貧血模型小鼠淋巴細(xì)胞亞群和脾臟組織的影響*

黃邦榮，展銳，倪紅，楊佳華，王蘭英，張永萍，梁曦

(甘肅省中醫(yī)院腫瘤血液科，甘肅 蘭州 730050)

摘要目的：觀察蘭州方對(duì)再生障礙性貧血模型小鼠淋巴細(xì)胞亞群和脾臟組織的影響。方法：將90只BALB/C小鼠，隨機(jī)分為蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒組，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組，每組15只。造模成功后第8天起，蘭州方大、中、小劑量組分別予以0.02，0.01，0.005 g/(g·d)藥液(當(dāng)于成人用量的40,20,10倍)灌胃；貞芪扶正顆粒組予以0.01 g/(g·d)(相當(dāng)于成人臨床用量的20倍)灌胃；正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)40 d。脫頸處死小鼠，無菌條件下剖腹取出脾臟，采用免疫組化法測(cè)CD4+、CD8+含量及CD4+/CD8+的值，并觀察各組脾臟病理組織學(xué)變化。結(jié)果：蘭州方能使脾臟CD4+含量呈增高趨勢(shì)、CD8+含量呈降低趨勢(shì)，同時(shí)提高CD4+/CD8+值；蘭州方可減輕模型小鼠脾臟病理學(xué)改變，明顯降低脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡率, 促進(jìn)生發(fā)中心恢復(fù)。結(jié)論：蘭州方能調(diào)節(jié)機(jī)體紊亂的免疫狀態(tài)，提高CD4+、降低CD8+的數(shù)量和活性,調(diào)整CD4+/CD8+值,對(duì)再障小鼠脾臟組織有顯著改善作用。

關(guān)鍵詞再生障礙性貧血； 蘭州方； 淋巴細(xì)胞亞群；脾臟組織；動(dòng)物；小鼠

再生障礙性貧血屬中醫(yī)學(xué)“血虛”“血證”“虛勞”“虛損”及“血枯”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：血與氣、血與精的關(guān)系密切。氣屬陽(yáng)，血屬陰，血液的生成有賴于氣，氣可生血，血可化氣，精血互化。精系生命之根本，閉藏于腎中，腎精生髓，精髓能化生血液。全國(guó)著名中西醫(yī)結(jié)合專家裴正學(xué)教授認(rèn)為:健脾補(bǔ)腎是治療再生障礙性貧血的根本大法。蘭州方是在此理論基礎(chǔ)上根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制而成，具有補(bǔ)腎生髓、健脾益氣、養(yǎng)血和胃功效，臨床治療再生障礙性貧血、調(diào)整機(jī)體免疫功能收效良好。為進(jìn)一步研究中醫(yī)健脾補(bǔ)腎理論治療再障的作用機(jī)制，本研究觀察了蘭州方對(duì)再障模型小鼠淋巴細(xì)胞亞群和脾臟組織的影響。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

健康BALB/C小鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2g), 8～10周齡，DBA/2小鼠10只，雌雄各半，8周齡[1]，由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第14-009號(hào)。

1.2藥品與儀器

蘭州方由生地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、北沙參、人參須、潞黨參、太子參、桂枝、浮小麥、大棗、麥冬、五味子、炙甘草、白芍、墓頭回等組成，由甘肅省蘭州市薈萃堂制成顆粒沖劑，每包含生藥量36.25 g；貞芪扶正顆粒，由佛慈制藥有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào) Z62020416。 直線加速器，德國(guó)西門子Primus產(chǎn)品；VS-1300L型超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；BCD-213型低溫冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘處理儀、CM1900HE染色儀、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)，均為常州中威電子儀器廠產(chǎn)品；BP211D型電子天平，瑞士Sartorius公司產(chǎn)品。

1.3腺淋巴結(jié)細(xì)胞懸液制備

取DBA/2小鼠斷頸處死，用750 mL/L酒精浸泡5 min，常規(guī)消毒；無菌下取出胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝、腸系膜等處淋巴結(jié)；加少量生理鹽水，輕輕剪碎、碾碎，用200目尼龍網(wǎng)過濾；通過4#針頭使其成單細(xì)胞懸液；臺(tái)盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活性，活性細(xì)胞達(dá)95%以上[2]。

1.4分組與模型的建立

將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒組，每組15只。

造模方法參照姚軍等[3]再障造模和趙忻等[4]關(guān)于免疫介導(dǎo)小鼠再障模型方法改進(jìn)。除正常對(duì)照組外，將其余75只BALB/C小鼠經(jīng)直線加速器6Mv γ射線全身照射，照射高度100 cm，時(shí)間1 min，劑量3.0GY。照射4 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞懸液0.2 mL，細(xì)胞數(shù)1×106/只[5]。造模1周后，血常規(guī)、骨髓涂片檢測(cè)造模是否成功。血常規(guī)：經(jīng)尾靜脈采血，結(jié)果示模型組與正常對(duì)照組對(duì)比,白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白均明顯下降(P<0.01),見表1。 骨髓涂片：每組隨機(jī)取5只小鼠，脫頸處死后取出左側(cè)股骨,用4號(hào)針頭取1 mL RPMI-1640液沖出骨髓,滴于載玻片上推片，HE染色,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行骨髓組織形態(tài)學(xué)觀察[6]。結(jié)果顯示造模組小鼠骨髓增生低下，粒系平均<15%、紅系<7%、巨核細(xì)胞0～7個(gè)/HP；正常對(duì)照組骨髓增生活躍，粒系平均>40%、紅系平均>14%、巨核細(xì)胞45～72個(gè)/HP；兩組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果證實(shí):本實(shí)驗(yàn)所復(fù)制的免疫介導(dǎo)型再障小鼠模型是成功的[7]，可以按原方案進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05,**P<0.01。

1.5給藥方法

造模成功后第8天起，各組開始灌胃。蘭州方顆粒、貞芪扶正顆粒臨用前分別用蒸餾水充分溶解，根據(jù)文獻(xiàn)中人/小鼠用藥等效劑量換算法，中藥中劑量組相當(dāng)于成人臨床用量的20倍[8]。蘭州方大、中、小劑量組分別予以0.02，0.01，0.005 g/(g·d)藥液(相當(dāng)于成人用量的40,20,10倍)灌胃,貞芪扶正顆粒組每只0.01 g/(g·d)(相當(dāng)于成人臨床用量的20倍)灌胃，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)40 d[9]。灌胃期間，各組均以普通飼料喂養(yǎng)。

1.6檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行。免疫組化染色步驟[11]如下：① 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS液(pH值7.5±0.1)沖洗3次，每次3 min； ② 根據(jù)單克隆抗體的要求，加1 mL EDTA修復(fù)液(pH值8.0)，對(duì)組織抗原進(jìn)行修復(fù)；③ 每張切片加1滴過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS液沖洗3次，每次3 min；④ 除去PBS液，每張切片加1滴正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10 min；⑤ 除去動(dòng)物血清，每張切片加第一抗體，室溫下孵育60 min；⑥ PBS液沖洗3次，每次5 min，除去PBS液，每張切片加1滴生物素標(biāo)記的第二抗體KT-9707-c，Biotin-conjugated second Antibody(Rabbit)，室溫下孵育10 min，PBS液沖洗3次，每次3 min；⑦ 除去PBS液，每張切片加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；⑧ 除去PBS液，每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，鏡下觀察3～10 min；⑨ 自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS液沖洗返藍(lán)；⑩ DAB顯色，所有切片經(jīng)過梯度酒精逐級(jí)脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。過氧化物酶-抗過氧化物酶法，最終反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色，切片經(jīng)圖像分析軟件處理后，根據(jù)平均光密度值及目標(biāo)面積比得出陽(yáng)性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。

1.6.2脾臟組織病理學(xué)變化

灌胃結(jié)束，脫頸處死小鼠；無菌條件下剖腹取出脾臟，用40 g/L甲醛溶液固定；用體積分?jǐn)?shù)遞減的無水乙醇逐級(jí)脫水干燥，二甲苯透明，石蠟包埋,將每份標(biāo)本制成4 μm厚度的組織切片，每例標(biāo)本連續(xù)切制3片；脫蠟后分別進(jìn)行HE染色；在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行脾臟形態(tài)學(xué)觀察。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群含量對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠CD4+值下降，CD8+值升高，CD4+/CD8+降低,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，蘭州方中、小劑量組的CD4+值升高，CD8+值降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；而蘭州方大劑量組、貞芪扶正顆粒組CD4+升高、CD8+降低作用不顯著，CD4+/CD8+僅略升高，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

注:與正常對(duì)照組對(duì)比，*P>0.05,**P<0.05，***P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P>0.05， ##P<0.05，###P<0.01。

2.2各組小鼠脾臟組織病理學(xué)情況對(duì)比

模型對(duì)照組脾臟體積縮小,質(zhì)量減輕,色淡紅,脾被膜增厚,切片未見髓外造血, 脾小體萎縮,數(shù)目減少,脾組織結(jié)構(gòu)疏松,脾血竇擴(kuò)張,但不充血,呈貧血狀,部分區(qū)域可見脾小動(dòng)脈壁增厚及玻璃樣變。蘭州方中劑量組白髓面積可占50%～70%，生發(fā)中心恢復(fù)良好，擴(kuò)張的血竇基本恢復(fù)正常，呈充血狀態(tài)。小劑量組和貞芪扶正顆粒組白髓面積、脾小體數(shù)量、生發(fā)中心、被膜和血竇均不同程度恢復(fù)。大劑量組則恢復(fù)較慢，僅比模型對(duì)照組略優(yōu)。小鼠脾臟病理切片見圖1～12。

3討論

大量研究表明，再障患者存在T淋巴細(xì)胞亞群失衡。CD8+細(xì)胞異常激活,導(dǎo)致抑制性細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等分泌異常增多[12]，協(xié)同對(duì)造血起負(fù)調(diào)控作用，導(dǎo)致造血干和(或)祖細(xì)胞增殖、分化缺陷[13]。IL-2、TNF-α、IFN-γ 等細(xì)胞因子不僅能直接抑制造血細(xì)胞的增殖[14]，而且還可通過Fas抗原(CD95)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)CD34細(xì)胞的程序性死亡，從而導(dǎo)致造血衰竭[15]。

本研究表明，蘭州方可使再障模型小鼠脾臟CD4+含量呈增高趨勢(shì)、CD8+含量呈降低趨勢(shì)，同時(shí)調(diào)整CD4+/CD8+值，具有免疫調(diào)節(jié)作用。小鼠脾臟病理組織切片觀察表明，蘭州方可減輕再障模型小鼠脾臟病理學(xué)改變，降低淋巴細(xì)胞的凋亡率，促進(jìn)生發(fā)中心的恢復(fù)，使白髓面積擴(kuò)大，被膜變薄，擴(kuò)張的血竇基本恢復(fù)正常。蘭州方大劑量組作用不明顯，考慮與中藥劑量過大，超過小鼠胃腸之負(fù)荷，導(dǎo)致一系列功能紊亂，同時(shí)中藥劑量過大亦會(huì)產(chǎn)生一定毒副作用，提示我們?cè)谂R床用藥時(shí)應(yīng)把握中藥的劑量，尤其對(duì)小兒患者，更應(yīng)謹(jǐn)慎用藥。

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(編輯陶珠)

文章編號(hào):1001-6910(2016)01-0054-05

中圖分類號(hào):R556.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.01.25

作者簡(jiǎn)介

黃邦榮(1979—)，男(漢族)，甘肅民勤人，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤及血液病的中西醫(yī)結(jié)合診療工作。

* 基金項(xiàng)目：甘肅省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(GZK-2012-23)

收稿日期：2015-02-08；修回日期：2015-09-09