GTA/AVC雙重抑制劑對C6腦神經膠質瘤細胞作用的影響

任吉野，秦虹，任吉祥

(1.松原市前郭縣中醫院，神經內科 吉林 松原 138000；2.長春市中醫院 心電超聲科， 吉林 長春 130022；3.長春中醫藥大學附屬醫院 腦病科，吉林 長春 130021)

GTA/AVC雙重抑制劑對C6腦神經膠質瘤細胞作用的影響

任吉野1，秦虹2，任吉祥3Δ

(1.松原市前郭縣中醫院，神經內科 吉林 松原 138000；2.長春市中醫院 心電超聲科， 吉林 長春 130022；3.長春中醫藥大學附屬醫院 腦病科，吉林 長春 130021)

目的 探討GTA/AVC雙重抑制劑對C6腦神經膠質瘤細胞作用的影響。方法 C6腦神經膠質瘤細胞采用不同濃度GTA/AVC雙重抑制劑(1 000、1 500、2 000 μg/mL)處理不同時間(12、48、72 h)，MTT法檢測細胞增殖活性，流式細胞術檢測細胞周期的變化。結果 GTA/AVC雙重抑制劑對C6腦神經膠質瘤細胞具有明顯的抑制作用，并在48 h作用最為明顯。GTA/AVC雙重抑制劑(2 000 μg/mL)能顯著升高G0/G1期細胞的比率，降低S期細胞比率；細胞凋亡率明顯高于空白對照組及GTA/AVC雙重抑制劑 (1 000 μL/mL) 治療組 (P<0.05)。結論 GTA/AVC雙重抑制劑可能通過調節細胞周期進程，抑制細胞增殖，發揮抗腫瘤細胞生長作用。

GTA/AVC雙重抑制劑；C6神經膠質瘤細胞；流式細胞術

腦膠質細胞瘤是中樞神經系統最常見的腫瘤，約占顱內腫瘤的80%，預后差且易復發[1]。目前國內外對于該病的治療仍以手術和放、化療相結合為主，由于腦膠質瘤侵襲性生長，手術很難徹底切除，術后極易復發；而放、化療對腦膠質瘤細胞缺乏特異性；大多數化療藥物不僅易產生耐藥性，同時會對人體的正常組織產生不良的影響[2]。迄今為止，國內外已研究的抗腫瘤藥物眾多，但多數價格昂貴且不良反應大。同時也存在耐藥性問題，使其臨床應用受到一定限制[3-5]，隨著醫學實踐不斷發展及探索發現許多生物活性肽對抑制腫瘤細胞增殖和轉移有良好的功效，且具有選擇性高、不良反應小等優點[6-8]。為此，尋找高效、低毒、價廉并對人體損傷較小的抗腫瘤活性肽治療的藥物成為近年來研究的熱點。本實驗采用的GTA/AVC雙重抑制劑為本研究室設計并合成，研究其對C6神經膠質瘤細胞作用的影響，并通過檢測對神經膠質瘤細胞增殖及細胞周期等變化，初步探討其抑制神經膠質瘤細胞可能作用的機制，為進一步研究在臨床上治療神經膠質瘤提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、主要試劑及藥品:腦神經膠質瘤C6細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

細胞周期檢測試劑盒(產品編號：C1052) 由江蘇碧云天生物技術研究所產品；二甲基亞砜 、四甲基偶氮唑藍 (MTT) 均為 美國Sigma 公司產品；標準胎牛血清(天津灝洋生物制品科技有限責任公司，批號：TBD31HB)；GTA/AVC雙重抑制劑，由上海吉爾公司合成，純度為98%；卡莫司汀購自天津金耀藥業有限公司(批號：1407011)。

1.1.2 主要儀器：NiKon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本尼康公司)；NCO-15AC 二氧化碳培養箱 (日本三樣電機株式會社；BSC-BOOⅡB2 AN YANG 超凈臺 (蘇州安洋科技發展有限公司；guava easyCyte 6HT-2L流式細胞儀(默克密理博中國)；MODEL550型酶標儀(上海BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞存活率：取對數生長期C6細胞，加入0.25% 胰酶2 mL消化；用PBS終止消化；離心，1 500 r/min，5 min； 棄上清，細胞計數，細胞濃度為1×104/mL； 細胞接種至96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，終體積200 μL；待細胞貼壁后，隨機分為空白對照組、卡莫司汀組及不同濃度GTA/AVC雙重抑制劑1 000、1 500、2 000 μg/mL組，20 μL/每孔，空白對照組加入等體積的培養液，每組分別設8個復孔。置入37 ℃、5%CO2培養，分別孵育24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT孵育4 h，以DMSO每孔150 μL終止反應。將96孔板移入平板振蕩器，水平振蕩10 min。用酶聯免疫檢測儀于490 nm波長測定吸光度(A)值，以空白對照孔A值調零，記錄結果。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期：細胞經藥物處理48 h后，收集細胞，加入冰冷的磷酸鹽緩沖液， 將細胞輕輕吹打成單個細胞，離心，PBS洗2次，用500 μLPBS從懸細胞，每離心管中加入(各100 μL 1 mg/mL PI、10 mg/mL RNaseA、0.01%TritonX-100)，37 ℃避光染色30 min。采用流式細胞儀測定細胞周期變化，本實驗重復3次，結果以各個細胞周期所占的百分率表示。

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞活性 結果顯示，不同劑量GTA/AVC雙重抑制劑作用C6腦膠質瘤細胞在24h時，各實驗組顯微鏡下觀察細胞呈梭形。各實驗組之間抑制的作用也無顯著性差異。在48 h時，GTA/AVC雙重抑制劑對C6細胞具有明顯的抑制作用，空白對照組略呈旋渦狀生長，GTA/AVC雙重抑制劑 2 000 μg/mL 組與正常對照組及1 000 μg/mL組比較具有顯著性差異(P<0.05)；在72 h時，各實驗組細胞生長均加快，均呈現旋渦狀生長。其中，卡莫司汀組和GTA/AVC雙重抑制劑組的細胞生長較空白對照組細胞生長略微緩慢。提示，細胞生長 72 h， GTA/AVC雙重抑制劑對C6細胞生長無抑制作用。結果見圖1、表1。

圖1 GTA/AVC雙重抑制劑對C6細胞活性的影響(20×)Fig.1 Effects of GTA/GVA double inhibitor on the activity of C6 cells(20×)

組別抑制率(%)24h48h72h正常對照組0 201±0 0340 247±0 0370 250±0 043卡莫司汀組0 194±0 0300 193±0 034?0 221±0 039GTA/AVC雙重抑制劑1000μg/mL0 201±0 0250 231±0 0630 218±0 032GTA/AVC雙重抑制劑1500μg/mL0 199±0 0370 194±0 036?0 212±0 025GTA/AVC雙重抑制劑2000μg/mL0 200±0 0280 183±0 035?#0 215±0 023

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal group；#P<0.05，與1 000 μg/mL組比較，compare with 1000 μg/mL group

2.2 GTA/AVC雙重抑制劑對C6神經膠質瘤細胞周期變化的影響 研究顯示，GTA/AVC雙重抑制劑作用48 h能夠引起C6膠質瘤細胞周期發生明顯改變，GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μg/mL組與正常對照組比較及1 000 μL/mL組比較G0/G1期比率明顯升高，S期細胞數比率下降，比較差異有統計學意義(P<0.05)；GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組與卡莫司汀組比較無統計學意義。表明GTA/AVC雙重抑制可明顯抑制C6膠質瘤細胞的進程。見圖2、表2。

圖2 GTA/AVC雙重抑制劑對C6細胞周期的影響Fig.2 Effects of GTA/AVG double inhibition on the cell cycle of C6 cells

G0/G1SG2/M正常對照組46 41±8 5749 67±8 943 92±4 00卡莫司汀組62 68±2 9836 23±3 491 08±0 55GTA/AV雙重抑制劑1000μg/mL52 88±2 7144 36±0 342 78±2 63GTA/AV雙重抑制劑1500μg/mL58 82±1 7040 09±2 321 10±0 65GTA/AV雙重抑制劑2000μg/mL67 75±3 27?#28 88±2 32?2 77±2 09

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal group；#P<0.05，與1 000 μg/mL組比較，compared with 1 000 μg/mL group

3 討論

神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，預后較差。其發病率近年來有所升高，且其發病群體呈現年輕化趨勢[9]。膠質瘤對機體最大的影響是其對腦組織的壓迫癥狀。在臨床膠質瘤的治療中，手術是其首選的治療方法。但手術并不能徹底清除膠質瘤，因膠質瘤本身增殖迅速，且侵襲性強，故術后依然會有部分侵襲到遠處的膠質瘤細胞，這些膠質瘤細胞又會在短期內迅速增殖，形成新的膠質瘤團塊而產生新的壓迫癥狀[10]。因此，膠質瘤患者術后均要常規進行針對殘留膠質瘤細胞的輔助治療。目前臨床常用的輔助治療措施依然是放、化學治療，但此2種治療方法因為副作用大，患者往往不能耐受[11]。為此，尋找高效、低毒、療效穩定的抗腫瘤藥物仍是目前研究開發的熱點，而多肽藥物恰恰具備了這些優點。

腫瘤的發生是多途徑、多步驟的，還與細胞凋亡有關，細胞增殖與凋亡之間的平衡失調與腫瘤的發生、發展密切相關。因此，抑制腫瘤細胞周期的進程及腫瘤細胞增殖，已成為腫瘤治療的重要手段之一[12-15]。本實驗選用MTT法及流式細胞術檢測細胞增殖及誘導凋亡情況，結果顯示，GTA/AVC雙重抑制劑對C6腦神經膠質瘤細胞增殖具有抑制作用，并在48 h作用最為明顯，鏡下可見空白對照組細胞生長狀態良好，GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組較空白對照組及GTA/AVC雙重抑制劑 1 000 μL/mL組抑制作用更強，比較差異有統計學意義(P<0.05)。表明GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組細胞生長受到明顯抑制。

據文獻報道，腫瘤細胞的基本生物學特性表現為細胞的分化與增殖調控失常[16]。近年來研究發現細胞周期調控異常與多種惡性腫瘤發生、發展和預后密切相關。結果表明，GTA/AVC雙重抑制劑與卡莫司汀誘導C6腦膠質瘤細胞的凋亡，均可使G0/G1期細胞百分數增加；GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組與卡莫司汀組比較差異無統計學意義，GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組與GTA/AVC雙重抑制劑1 000 μL/mL組比較差異有統計學意義(P<0.05)，且S期細胞百分數減少，表明進入DNA合成期的細胞減少。因此，推測GTA/AVC雙重抑制劑對C6腫瘤細胞生長是通過阻滯G0/G1期細胞，使S期細胞減少，誘導細胞凋亡，并且這種作用表現為具有一定的時間和劑量依賴性。

綜上所述，GTA/AVC雙重抑制劑可能通過阻斷腫瘤細胞DNA的合成與復制，抑制細胞分裂、降低細胞增殖能力，從而抑制腫瘤細胞的生成。

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(編校：吳茜)

Effect of GTA/AVC double inhibitors on C6 brain nerve glima cells

REN Ji-ye1, QIN Hong2, REN Ji-xiang3Δ

(1.Department of Traditional Chinese Internal Medicine, Qian Guo County Hospital of Traditional Chinese Medicine, Songyuan 138000; China; 2.Department of Electrocardio-ultrasound, Changchun City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130021, China; 3.Department of Encephalopaty,Affiliated Hospital of Changchun University of Tradtional Chinese Medicine, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo study the effect of GTA/AVC dual inhibitors on C6 brain nerve glima cells. MethodsMTT method was used to test the brain glioma cells activity of proliferation at different times(12 h,48 h,72 h), and using the flow cytometry to detect the change of cells cycle. ResultsIt has obvious inhibitory effcets on C6 brain nerve glima cells, and it was the most obvious at 48 h. GTA/AVC dual inhibitor(2000 μg/mL)treatment group remarkbly rise the G0/G1 rate of celluar, S-phase cell ratio descend,and the cells apoptosis rate was markedly increased.Compared with the control group and the GTA/AVC dual inhibition (1000 μL/mL)treatment group , were significant difference(P<0.05).Conclusionregulating cells cycle progression.

GTA/GVA double inhibitor; C6 brain nerve glima cells; flow cytometry

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.008

任吉野，男，主治醫師，研究方向：中醫內科學，E-mail：renjy1980@163.com；任吉祥，通信作者，男，副教授，研究方向：中醫內科腦病，E-mail：renjx@163.com。

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