刺激響應性聚N-乙烯基己內酰胺納米凝膠的制備及性能研究

王　楊，顧　準

(蘇州健雄職業技術學院生物與化學工程系，江蘇 太倉 215411)

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刺激響應性聚N-乙烯基己內酰胺納米凝膠的制備及性能研究

王楊，顧準

(蘇州健雄職業技術學院生物與化學工程系，江蘇 太倉 215411)

摘要：以N-乙烯基己內酰胺(VCL)為主單體，通過水相沉淀聚合制備刺激響應性聚N-乙烯基己內酰胺(PVCL)納米凝膠。利用動態光散射(DLS)、紅外光譜(FTIR)、拉曼光譜(Raman)和透射電鏡(TEM)等考察了交聯劑(MBA或BAC)、親水性共聚單體(MAA)對PVCL納米凝膠性能的影響。結果表明，增大交聯劑的親水性、增加交聯劑和MAA的用量均可增大PVCL納米凝膠的粒徑；PVCL納米凝膠具有溫度和pH值響應性，能夠在還原性環境中發生降解。細胞毒性實驗表明，PVCL納米凝膠細胞毒性小、生物相容性好，適合用作藥物載體。

關鍵詞：N-乙烯基己內酰胺(VCL)；水相沉淀聚合；納米凝膠；還原降解；細胞毒性

聚合物納米凝膠是一類內部具有交聯網絡結構、在溶劑中溶脹、不溶解、能夠穩定分散的聚合物納米粒子。聚合物納米凝膠由親水性聚合物或環境敏感性聚合物組成，通過對環境的響應，發生相應的膨脹或收縮[1]。溫度是研究最廣泛的環境刺激因素之一，如果凝膠網絡內的聚合物具有溫度響應性，則會表現出溫度敏感的相轉變行為[2]。聚N-乙烯基己內酰胺(PVCL)是近年來被人們廣泛研究的溫度響應性聚合物之一，與聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)相比，PVCL具有相似的溫度響應性和更好的生物相容性[3-4]，被廣泛用于組織工程和藥物載體。PVCL納米凝膠的體積相轉變溫度(VPTT)為31～38 ℃，在制備過程中可通過共聚親水性或者疏水性單體調節[5]。

水相沉淀聚合具有操作簡便、綠色環保、制備的粒子均勻且尺寸小等優點，是制備溫度響應性聚合物納米凝膠的常用方法之一[6]。通過引入環境敏感、可斷裂的交聯點，賦予聚合物納米凝膠生物降解性、提高聚合物納米凝膠的生物相容性[7-8]。細胞內還原性谷胱甘肽(GSH)的濃度為2～10mmol·L-1，遠大于細胞外GSH的濃度(2～10μmol·L-1)[9]，因此細胞內外存在還原勢的差異。二硫鍵在人體的正常體溫、pH值和氧化等環境下非常穩定，而在一定量的谷胱甘肽還原酶或二硫蘇糖醇(DTT)等還原劑存在下易被還原生成巰基[10]。因此，含有二硫鍵交聯劑的聚合物納米凝膠在進入還原勢較低的細胞內時二硫鍵會發生斷裂，導致降解。

作者采用水相沉淀聚合方法制備了刺激響應性PVCL納米凝膠，并對其進行了動態光散射(DLS)、紅外光譜(FTIR)、拉曼光譜(Raman)、透射電鏡(TEM)表征，考察了交聯劑和親水性共聚單體對其性能的影響，研究了交聯劑為N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)或N,N′-雙(丙烯酰)胱胺(BAC)的PVCL納米凝膠粒子在還原性環境中的降解性及細胞毒性。

1實驗

1.1試劑與儀器

N-乙烯基己內酰胺(VCL，質量分數99%)、BAC(質量分數98%)、鹽酸阿霉素(98%),百靈威科技有限公司；MBA(質量分數99%)、二硫蘇糖醇(DTT，質量分數99%)、溴化噻唑藍四氮唑(MTT，質量分數98%)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；甲基丙烯酸(MAA，質量分數99%，減壓蒸餾)、過硫酸鉀(KPS，質量分數99%，在水中重結晶)、碳酸氫鈉(質量分數99%)、十二烷基硫酸鈉(SDS，質量分數99%)、N,N′-二甲基亞砜(DMSO，質量分數99%)，國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

MalvenNano-ZS90型動態光散射儀，英國馬爾文儀器有限公司；HitachiH-600型透射電子顯微鏡，日本Hitachi公司；UV-VisLambda35型紫外可見吸收光譜儀，美國Lambda公司；AVANCEⅢ型Bruker500MHz核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司；NicoletNexus-440型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司；LabRam-1B型拉曼光譜儀，法國Dior公司；EL311型酶標免疫檢測儀，美國BioTek公司；3164型水套式CO2培養箱，美國FormaScientific公司。

1.2方法

1.2.1PVCL納米凝膠的制備

準確稱取一定質量的VCL、MAA、溶解于2 mL DMSO 的MBA/BAC及40 mg SDS、25 mg NaHCO3，溶解于100 mL雙蒸水后加入配有球形冷凝管的150 mL三口燒瓶中，于200 r·min-1下攪拌，向體系中持續通入氮氣，使反應一直處于惰性環境。通氮氣0.5 h后，升溫至70 ℃并穩定10 min，快速加入2 mL濃度為12.5 mg·mL-1的KPS水溶液，開始聚合反應。6 h后停止加熱，保持氮氣環境冷卻至室溫。最后將產物轉移到截留分子量為14 000 Da的透析袋中，透析7 d以除去未反應的單體和其它雜質。改變VCL、MAA、MBA/BAC的用量以制備不同粒徑的PVCL納米凝膠。合成路線如圖1所示。

1.2.2PVCL納米凝膠的表征

采用動態光散射儀測定PVCL納米凝膠的粒徑；采用透射電鏡觀察其形貌；通過FTIR、Raman表征其結構。

1.2.3PVCL納米凝膠的溫度與pH值響應性實驗

采用動態光散射儀測定PVCL納米凝膠的粒徑隨溫度、pH值和MAA用量的變化，研究PVCL納米凝膠的溫度與pH值響應性行為；通過測定PVCL納米凝膠在25 ℃時電勢隨MAA用量和環境pH值的變化，研究PVCL納米凝膠的pH值響應性。所測PVCL納米凝膠的濃度為1.0 mg·mL-1。

1.2.4PVCL納米凝膠的還原降解實驗

采用動態光散射儀測定PVCL納米凝膠在還原介質DTT中的散射光強隨時間的變化，分析其還原降解行為。分別配制pH值為6.5、7.4、8.3的DTT濃度為10 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液，加入少量P(VCL-MBA-MAA)或P(VCL-BAC-MAA)納米凝膠置于37 ℃空氣浴中，在設定時間取出少許樣品直接用動態光散射儀測定散射光強。通過計算不同時間點的散射光強與初始散射光強的比值，分析降解過程中PVCL納米凝膠相對濁度的變化。以初始散射光強為參照標準，設相對濁度初始值為100%。

1.2.5MTT法細胞毒性實驗

細胞毒性通過常規的MTT法測定，采用人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)評價PVCL納米凝膠的生物相容性。HK-2細胞用DMEM培養液在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每3 d更換一次培養液。細胞株以每孔1×104個細胞的密度接種到96孔培養板上，在含有5% CO2的濕潤空氣氛圍下培養24 h后，棄培養液，并用新鮮磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，再分別加入新鮮的一定濃度的P(VCL-MBA-MAA)或P(VCL-BAC-MAA)。平行操作3份。48 h后，吸出孔內的上清液，用新鮮磷酸鹽緩沖溶液洗滌后在每孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，37 ℃下繼續培養4 h。棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，使結晶物充分溶解。使用自動酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD490)。按下式計算細胞抑制率：

2結果與討論

2.1PVCL納米凝膠的粒徑(表1)

從表1可以看出，(1)交聯劑不同，得到的PVCL納米凝膠的粒徑也不同。如P(VCL-MBA4-MAA0)的粒徑(430 nm)遠大于P(VCL-BAC4-MAA0)的粒徑(212 nm)。這是因為，相比于BAC，MBA的親水性較好，因此與親水性的VCL更容易發生共聚，從而使開始形成的初始粒子更容易繼續共聚剩余的單體和寡聚物，形成較大的粒子。(2)隨著交聯劑MBA用量的增加，粒徑隨之增大。這是因為，MBA用量增加，致使VCL轉化率提高，聚合反應的單體總轉化率也提高，PVCL納米凝膠的粒徑相應增大[5]。(3)在BAC用量一定時，PVCL納米凝膠的粒徑隨MAA用量的增加逐漸增大，且具有較窄的粒徑分布(PI<0.1)。這是因為，隨著MAA用量的增加，PVCL納米凝膠中親水的PMAA鏈增多，親水性增強，更易膨脹，粒徑相應增大[11]。

表1PVCL納米凝膠的粒徑

注：MBA、MAA、BAC后的數字分別表示MBA、MAA、BAC相對于單體(VCL+MAA)的質量分數，%；D為在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中測得的粒徑；PI為粒徑的分散系數。

2.2紅外光譜分析(圖2)

由圖2可知，3種PVCL納米凝膠紅外光譜中，2 927～2 856 cm-1處均出現了-CH2的伸縮振動峰[12]，1 630 cm-1和1 481～1 439 cm-1處均出現了PVCL的酰胺C=O和C-N的特征峰[13]；在P(VCL-BAC4-MAA4)的紅外光譜中，1 726 cm-1處出現了明顯的肩峰，對應于PMAA中羰基的伸縮振動[13]。表明通過共聚MAA成功地將PMAA引入聚合物網絡中。

2.3拉曼光譜分析(圖3)

由圖3可知，在P(VCL-BAC4-MAA0)的拉曼光譜中，可清楚地看到510 cm-1處出現了二硫鍵(-S-S-)的特征吸收峰[14]，而P(VCL-MBA4-MAA0)的拉曼光譜中卻沒有出現。表明二硫鍵通過共聚交聯劑BAC已成功地引入聚合物網絡。

2.4透射電鏡分析(圖4)

由圖4可看出，納米凝膠P(VCL-BAC4-MAA0)和P(VCL-MBA4-MAA0)均呈均勻、規則的球狀形貌，并且前者的粒徑小于后者。表明交聯劑對PVCL納米凝膠的粒徑影響顯著，與表1結果相符。

BAC用量一定、MAA用量不同的PVCL納米凝膠的TEM照片如圖5所示。

由圖5可看出，所有納米凝膠粒子均呈均勻、規則的球狀形貌，粒徑隨著MAA質量分數的增加而增大，與PVCL納米凝膠的粒徑變化規律相符。

2.5PVCL納米凝膠的環境響應性

2.5.1溫度響應性

(1)溫度對PVCL納米凝膠粒徑的影響(圖6)

由圖6可知，2種PVCL納米凝膠均表現出明顯的溫度響應性，即隨著溫度的升高，PVCL納米凝膠變得疏水且開始收縮，表現為粒徑減小；MBA交聯的納米凝膠的VPTT(32.2 ℃)高于BAC交聯的納米凝膠

(30.3 ℃)。這是因為，MBA親水性較好，增強了粒子與水分子之間的相互作用，從而一定程度上限制了疏水性聚合物網絡的收縮。

(2)MAA用量對PVCL納米凝膠VPTT的影響(表2)

表2MAA用量對PVCL納米凝膠VPTT的影響

Tab.2 Effect of MAA dosage on VPTT of PVCL nanogels

由表2可知，隨著MAA用量的增加，BAC交聯的PVCL納米凝膠的VPTT逐漸升高。這是因為，隨著MAA用量的增加，聚合物鏈的親水性和靜電排斥作用均增強，破壞聚合物鏈之間親疏水作用的平衡需要較高的溫度，從而導致VPTT升高[15]。

2.5.2pH值響應性

(1)MAA用量對PVCL納米凝膠Zeta電勢的影響(表3)

表3MAA用量對PVCL納米凝膠Zeta電勢的影響

Tab.3Effect of MAA dosage on Zeta potential of PVCL nanogels

注：Zeta電勢在25 ℃、不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液中測得。

PVCL納米凝膠由于共聚了親水性單體MAA，使其表面帶有羧基，因此表現出明顯的pH值響應性。由表3可知，PVCL納米凝膠的Zeta電勢與pH值和MAA用量有關。pH值越大、MAA用量越多，PVCL納米凝膠表面的負電荷就越多，Zeta電勢相應越低。

(2)pH值對PVCL納米凝膠粒徑和Zeta電勢的影響(圖7)

由圖7可知，P(VCL-BAC4-MAA3)的粒徑隨pH值的增大而增大，Zeta電勢隨pH值的增大而降低。這是因為，pH值的增大使粒子表面的負電荷增多，羧基之間的靜電排斥作用增強，粒子發生膨脹，因此粒徑增大。

2.5.3溫度/pH值耦合響應性

由表2可知，PVCL納米凝膠還具有溫度/pH值耦合響應性，VPTT隨著pH值的增大和MAA含量的增加而升高。對于P(VCL-BAC4-MAA3)納米凝膠，當pH值從5.5增大至7.4時，VPTT從28.5 ℃升高到47.5 ℃。pH值較大時，聚合物中的PMAA離子化程度高，使聚合物鏈之間靜電排斥作用增強，導致較高的VPTT，這與凝膠粒子在相應條件下電勢的變化相符(表3)。pH值較小時，羧基電離程度減弱，凝膠粒子表面負電荷減少，靜電排斥作用減弱，導致VPTT向低溫方向移動。如，在pH=5.5的酸性環境中，PMAA電離程度減弱，使聚合物鏈之間的靜電排斥作用減弱，降低了粒子的穩定性[16]，造成MAA相對于單體質量分數小于3%的凝膠粒子在溫度達到VPTT之前就發生聚集，因此無法得到準確的VPTT值。

2.6PVCL納米凝膠的還原降解性

P(VCL-MBA4-MAA0)和P(VCL-BAC4-MAA0)在不同pH值、10 mmol·L-1DTT中的相對濁度隨時間的變化如圖8所示。

由圖8可知，P(VCL-MBA4-MAA0)在不同pH值環境中均很穩定，在24 h內相對濁度幾乎未發生變化；P(VCL-BAC4-MAA0)在不同pH值條件下的相對濁度均發生了不同程度的降低，表明粒子發生了降解。如，在pH=8.3和pH=7.4條件下，P(VCL-BAC4-MAA0)納米凝膠在30 min內幾乎完全降解；在pH=6.5條件下，150 min內相對濁度降低近50%。表明，還原劑DTT使粒子內部的二硫鍵發生斷裂而還原成巰基，粒子發生降解。由于DTT在高pH值條件下的還原能力較強，因此粒子降解的速度較快。

2.7PVCL納米凝膠的細胞毒性(圖9)

由圖9可知，在1～500 μg·mL-1濃度范圍內，兩種PVCL納米凝膠對HK-2細胞的生長均未產生明顯的抑制作用，即使在濃度高達100 μg·mL-1時，細胞的存活率仍然接近100%，這與PVCL納米凝膠具有良好的生物相容性有關。表明，PVCL納米凝膠的細胞毒性小、生物相容性好，非常適合用作藥物載體。

3結論

以N-乙烯基己內酰胺(VCL)為主單體、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)或N,N′-雙(丙烯酰)胱胺(BAC)為交聯劑、甲基丙烯酸(MAA)為親水性共聚單體，采用水相沉淀聚合法制備了刺激響應性PVCL納米凝膠，研究了交聯劑及MAA對PVCL納米凝膠性能的影響。紅外光譜和拉曼光譜表明，所制備的PVCL納米凝膠符合分子設計，電鏡下呈規則、均勻的球形；隨著交聯劑親水性和用量的增加、MAA用量的增加，制得的PVCL納米凝膠的粒徑增大；制備的PVCL納米凝膠粒子具有溫度/pH值響應性，MBA為交聯劑的PVCL納米凝膠在還原性介質中很穩定，而BAC為交聯劑的PVCL納米凝膠在還原性介質中由于二硫鍵發生還原性斷裂而降解；制備的PVCL納米凝膠細胞毒性小、生物相容性好，適合用作藥物載體。

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Preparation and Performance of Stimuli-ResponsivePoly(N-vinylcaprolactam) Nanogel

WANG Yang,GU Zhun

(DepartmentofBiologicalandChemicalEngineering,SuzhouChien-ShiungInstituteofTechnology,Taicang215411,China)

Keywords：N-vinylcaprolactam(VCL);waterprecipitationpolymerization;nanogel;reductivedegradation;cytotoxicity

Abstract：UsingN-vinylcaprolactam(VCL)asamainmonomer,stimuli-responsivepoly(N-vinylcaprolactam)(PVCL)nanogelswerepreparedbyawaterprecipitationpolymerizationmethod.Theeffectsofcross-linker(MBAorBAC)andhydrophiliccomonomer(MAA)ontheperformanceofPVCLnanogelswereinvestigatedbyDLS,FTIR,RamanandTEM.ResultsindicatedthattheparticlesizeofPVCLnanogelsincreasedwithincreasingofthehydrophilicityofcross-linkerandthedosageofcross-linkerandcomonomerMAA.ThePVCLnanogelshadtemperatureandpHvalueresponsiveness,andtheycouldbedegradedinareductiveenvironment.ResultsofcytotoxicityexperimentindicatedthatPVCLnanogelspossessedlowcytotoxicityandexcellentbiocompatibility,thustheyweresuitableforusingasdrugcarriers.

基金項目：太倉市科技計劃應用基礎項目(TC2014YY02)，蘇州市生物醫藥綠色合成重點實驗室項目(SZSD201402)

收稿日期：2016-01-22

作者簡介：王楊(1979-)，女，江蘇連云港人，博士，講師，研究方向：醫用高分子材料，E-mail：wangyang_423@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.008

中圖分類號：O 632.7

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)06-0039-06