8種常見芽菜致病微生物的分離鑒定

張安華蔡　翔陳　濤王　萍祝菊紅趙志遠

（1武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院作物科學(xué)研究所，湖北武漢 430345；2武漢維爾福生物科技股份有限公司，湖北武漢 430345；3湖北維民種苗有限公司，湖北武漢 430207）

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8種常見芽菜致病微生物的分離鑒定

張安華1蔡翔2陳濤3王萍1祝菊紅1趙志遠1

（1武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院作物科學(xué)研究所，湖北武漢 430345；2武漢維爾福生物科技股份有限公司，湖北武漢 430345；3湖北維民種苗有限公司，湖北武漢 430207）

摘 要：對目前產(chǎn)業(yè)化程度較高的黃豆、黑豆、豇豆、蘿卜、蕹菜、花生、黃秋葵、向日葵等8種芽菜患病植株上的致病微生物進行分離、純化，共得到24株細(xì)菌菌株和8株真菌菌株；利用真菌ITS和細(xì)菌16S rDNA通用引物，分別對分離得到的細(xì)菌和真菌基因組進行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明：24株細(xì)菌分屬8個屬，分別為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）、短穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）、戴爾福特菌屬（Delftia）、從毛單孢菌屬（Comamonas）；24株細(xì)菌均為革蘭氏陰性菌，除果膠桿菌屬外，其余都不是典型的植物病原菌；其中不動桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和假單胞菌屬的細(xì)菌出現(xiàn)在2種或2種以上芽菜上；另外4個屬的細(xì)菌則只出現(xiàn)在1種芽菜上，呈現(xiàn)出寄主的專化性。8株真菌分屬3個屬，分別為鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）和根霉屬（Rhizopus）；其中根霉屬和鏈格孢屬的真菌分別只出現(xiàn)在蘿卜芽菜和蕹菜芽菜上，其他6種芽菜上分離得到的真菌菌株均屬于鐮刀菌屬。分離菌株回接試驗結(jié)果表明，所有菌株均能對芽菜造成不同程度的腐爛癥狀，生產(chǎn)過程中環(huán)境微生物污染同樣能致芽菜腐爛病發(fā)生。

關(guān)鍵詞：芽菜；致病微生物；真菌；細(xì)菌；分離鑒定

張安華，男，高級農(nóng)藝師，專業(yè)方向：作物栽培，E-mail：1259157360@qq.com

芽菜是利用農(nóng)業(yè)學(xué)上的種子在特定環(huán)境條件下培育出的可供食用的芽苗類蔬菜的總稱，具有適用品種多、生長周期短、單位產(chǎn)值高、易于工廠化生產(chǎn)等產(chǎn)品特性，以其安全、營養(yǎng)、保健等特點走入百姓餐桌（康玉凡 等，2008）。據(jù)統(tǒng)計，目前國內(nèi)市場上常見的芽苗菜種類達30種之多（袁星星等，2014）。工廠化生產(chǎn)過程中，芽菜腐爛問題一直困擾著生產(chǎn)企業(yè)，每年因芽菜腐爛造成的損失可達10%（李振華 等，2011；袁星星 等，2014）。張麗等（2010，2011）對國內(nèi)多家工廠化生產(chǎn)的芽菜進行取樣、鑒定，發(fā)現(xiàn)豆類芽菜生產(chǎn)中的主要真菌病害是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）以及立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的腐爛病。生產(chǎn)實踐中，不同種類和品種的芽菜感病癥狀和程度不盡一致，且表現(xiàn)出極強的季節(jié)差異。目前，國內(nèi)針對芽菜爛種、爛芽的研究多集中于種子帶菌的防控，而忽視了生產(chǎn)過程中的環(huán)境微生物污染。

本試驗以目前產(chǎn)業(yè)化程度較高的黃豆、黑豆、豇豆、蘿卜、蕹菜（空心菜）、花生、黃秋葵和向日葵等8種芽菜為試驗材料，對患病植株上的微生物進行采集、分離和菌株純化，采用分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法對微生物進行鑒定，確定病原微生物類型與致病性，旨在為科學(xué)高效防治芽菜腐爛病提供理論參考。

1　材料與方法

1.1樣品采集、分離及菌株純化

2014年3～6月，分別從湖北玉如意芽業(yè)集團和湖北維民種苗公司生產(chǎn)車間選取黃豆、蘿卜、蕹菜、花生、豇豆、黑豆、黃秋葵和向日葵等8種芽菜中有腐爛癥狀的患病植株，每種芽菜取15～25株，共取樣180株。

采用常規(guī)組織分離法進行病原物分離。培養(yǎng)過程中，若長出真菌則直接將其轉(zhuǎn)接至PDA平板上，培養(yǎng)5 d后挑取菌落邊緣菌絲塊接種至新的PDA平板上進行培養(yǎng)，重復(fù)進行3次，得到純化的真菌；若長出細(xì)菌則采用接種環(huán)在NA平板上劃線，培養(yǎng)24 h后挑取單菌落在NA平板上進行培養(yǎng)，重復(fù)進行3次，得到純化的細(xì)菌（方中達，1996）。

1.2病原微生物形態(tài)學(xué)鑒定

將純化的細(xì)菌菌株置于NA平板上，真菌菌株置于PDA平板上，在25 ℃條件下進行培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)24 h；真菌培養(yǎng)5～10 d。觀察、記載菌落培養(yǎng)性狀，根據(jù)菌落形態(tài)及顯微鏡下菌絲、孢子形態(tài)等特征進行鑒定。

1.3病原微生物分子生物學(xué)鑒定

1.3.1病原細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定 用牙簽挑取1個單菌落放入2 mL NA液體培養(yǎng)基中，置于25 ℃下?lián)u培24 h。然后采用細(xì)菌通用引物27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R （5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）直接對分離細(xì)菌菌體進行16S rDNA基因片段的擴增。PCR擴增反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（10 mmol·L-1）5.0 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）1.0 μL，TaKaRa Taq酶（5 U·μL-1）0.5 μL，引物1（20 μmol·L-1）1.0 μL，引物2（20 μmol·L-1）1.0 μL，菌液（濃度約為1×109cfu·mL-1）1.0 μL，ddH2O 40.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min（Innis et al.，1990）。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司測序。

1.3.2病原真菌分子生物學(xué)鑒定 將分離出的真菌接種在鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，從培養(yǎng)基上刮取0.2 g新鮮菌絲置于研缽中，采用CTAB法（Innis et al.，1990）進行DNA提取，然后將DNA濃度稀釋為50 ng· μL-1，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩２捎肐TS通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。PCR擴增體系與1.3.1細(xì)菌鑒定所采用的相同。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，59℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min（Innis et al.，1990）。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司測序。

1.4序列分析

測序結(jié)果利用DNAman軟件進行格式化，選擇2條引物（包含引物）之間的序列，通過BLAST （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）程序與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.5分離菌株回接試驗

選取生產(chǎn)實踐中發(fā)病較嚴(yán)重且表面分離到的微生物種類較多的蘿卜和蕹菜進行細(xì)菌回接試驗，采用黑豆進行真菌回接試驗。供試蘿卜品種為短葉十三，蕹菜品種為超白梗，黑豆品種為黑豆2號，種子千粒重分別為14.42、43.92、340.00 g，均由湖北玉如意芽業(yè)集團提供。

根據(jù)分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，選取分屬于3個屬的真菌HQK-1、KXC-1、LB-1進行培養(yǎng)，用血球計數(shù)板配制成含孢子1×106個·mL-1的孢子懸浮液。選取分屬于4個屬的細(xì)菌KXC-A、KXC-B、LB-A、LB-B進行培養(yǎng)，用平板菌落計數(shù)法配制成濃度為1×108cfu·mL-1的懸浮液。

選擇外觀整齊、籽粒飽滿的蘿卜種子、蕹菜種子和黑豆種子各100粒，用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，然后用自來水沖洗3次，自然風(fēng)干，分別用真菌孢子懸浮液或者細(xì)菌菌液浸泡4 h，以無菌水浸泡的種子作為對照，按照一般生產(chǎn)流程生產(chǎn)芽菜，觀察病害發(fā)生情況。每處理2次重復(fù)。

2　結(jié)果與分析

2.1微生物的分離

從8種芽菜患病植株上共分離得到24株優(yōu)勢細(xì)菌菌株、8株優(yōu)勢真菌菌株。分別為蕹菜：4 株細(xì)菌、1 株真菌；黃豆：2 株細(xì)菌、1 株真菌；黃秋葵：3 株細(xì)菌、1 株真菌；豇豆：2 株細(xì)菌、1 株真菌；花生：3 株細(xì)菌、1 株真菌；向日葵：4 株細(xì)菌、1 株真菌；蘿卜：3 株細(xì)菌、1 株真菌；黑豆：3 株細(xì)菌、1 株真菌。

2.2病原微生物形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

本試驗分離所得細(xì)菌均為白色或淺黃色，菌落邊緣平滑，培養(yǎng)24 h后菌落具流動性（圖1）。花生、黑豆、黃豆、豇豆、黃秋葵、向日葵上的真菌均為白色菌絲，培養(yǎng)5 d后產(chǎn)生紫紅色色素；蕹菜上的真菌KXC-1培養(yǎng)5 d后在菌落表面產(chǎn)生灰綠色的孢子；蘿卜上的真菌LB-1則生長迅速，培養(yǎng)48 h即可長滿培養(yǎng)皿（直徑9 cm），并產(chǎn)生黑色的孢子（圖2、3）。

圖1 部分芽菜細(xì)菌分離物在25 ℃、NA平板上培養(yǎng)24 h后的形態(tài)

圖2 8種芽菜病原真菌在25 ℃、PDA平板上培養(yǎng)7 d后的形態(tài)

圖3 部分芽菜真菌孢子形態(tài)

2.3病原微生物分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

采用引物27F和1492R擴增得到的不同細(xì)菌菌株的DNA片段長度約為1 400 bp；采用引物ITS1和ITS4擴增得到的不同真菌菌株的rDNA-ITS片段長度約為700 bp（圖4）。

經(jīng)BLAST比對分析，本試驗分離得到的24株細(xì)菌分屬8個屬，分別為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）、短穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）、戴爾福特菌屬（Delftia）和從毛單孢菌屬（Comamonas）。所有24株細(xì)菌均為革蘭氏陰性菌，其中，不動桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和假單胞菌屬的細(xì)菌分布于2種或2種以上的芽菜上；果膠桿菌屬和戴爾福特菌屬的細(xì)菌只出現(xiàn)在黃秋葵芽菜上；短穩(wěn)桿菌屬和從毛單孢菌屬的細(xì)菌則只出現(xiàn)在向日葵芽菜上（表1）。

圖4 ITS序列擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

本試驗分離得到的8株真菌分屬3個屬，分別為鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）和根霉屬（Rhizopus），其中鐮刀菌屬的真菌分布于6種芽菜上；鏈格孢屬和根霉屬的真菌僅分別出現(xiàn)在蕹菜和蘿卜芽菜上（表2）。

表1 基于16S rDNA測序?qū)?種芽菜上分離得到的24株細(xì)菌的鑒定結(jié)果

表2 基于ITS測序?qū)?種芽菜上分離得到的8株真菌的鑒定結(jié)果

2.4回接試驗結(jié)果

接種細(xì)菌菌液培養(yǎng)5 d后，蘿卜芽菜和蕹菜芽菜平均發(fā)病率分別為10%和20%；接種不同的病原菌腐爛程度不同，但發(fā)病癥狀相似。發(fā)病芽體呈水浸狀、褐色腐爛，有臭味，同時在下胚軸的中上部產(chǎn)生褐色菌膜（圖5）。培養(yǎng)7 d后2種芽菜的發(fā)病率均達到100%。

接種真菌孢子懸浮液4 d后，黑豆芽菜開始發(fā)病，接種鐮刀菌的芽菜下胚軸的中上部產(chǎn)生水漬狀病斑，芽體表面出現(xiàn)白色菌絲（圖6），接種8 d后白色菌絲發(fā)展為團狀菌落，周圍的芽菜均產(chǎn)生腐爛癥狀；接種根霉與鏈格孢的芽菜表面也有白色菌絲產(chǎn)生，并產(chǎn)生黑色和褐色的孢子，同時芽體產(chǎn)生水漬狀病斑，由于菌絲生長迅速，接種5 d后所有芽菜表面均布滿根霉或者鏈格孢的菌落，大量芽菜腐爛，失去食用價值。

回接試驗第8天，對照芽菜發(fā)病率僅為5.6%。

圖5 接種細(xì)菌5 d后蘿卜和蕹菜芽菜的發(fā)病癥狀

圖6 接種真菌后黑豆芽菜的發(fā)病癥狀

3　結(jié)論與討論

張麗等（2010，2011）對豆芽爛芽的病原菌分離鑒定及致病性研究表明，豆芽生產(chǎn)中的主要真菌病害是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）以及立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的腐爛病。本試驗結(jié)果表明，鐮刀菌同樣可致花生、黑豆、黃豆、豇豆、黃秋葵和向日葵芽菜腐爛；根霉和鏈格孢更是引發(fā)蘿卜芽菜和蕹菜芽菜腐爛的主要病原真菌。

本試驗分離得到的24株細(xì)菌分屬8個屬，除果膠桿菌屬外，均為環(huán)境腐生微生物，其中不動桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和假單胞菌屬是最為常見的食源性微生物，也是人類的機會致病菌。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因很可能是芽菜生產(chǎn)中對種子的精選和消毒處理降低了植物病原菌的種群數(shù)量，而環(huán)境微生物成為了主要微生物群體。因此，在芽菜腐爛病防控措施上，既要嚴(yán)格進行種子消毒，更應(yīng)重視生產(chǎn)過程的環(huán)境滅菌，以減少環(huán)境微生物污染。

果膠桿菌屬細(xì)菌和戴爾福特菌屬細(xì)菌只出現(xiàn)在黃秋葵芽菜上，短穩(wěn)桿菌屬細(xì)菌和從毛單孢菌屬細(xì)菌則只出現(xiàn)在向日葵芽菜上；鏈格孢屬真菌和根霉屬真菌分別僅出現(xiàn)在蕹菜芽菜和蘿卜芽菜上，其分布呈現(xiàn)出一定的專一性，說明不同種類芽菜上的微生物分布規(guī)律不盡相同。

在國外，芽菜上的微生物如大腸桿菌、沙門氏菌等既是重要的環(huán)境微生物，又是重要的食源性微生物和機會致病菌，其中大腸桿菌E.coli O157：H7還導(dǎo)致了一些公共衛(wèi)生事件，是研究的熱點（Erickson，2012）。我國對于芽菜上的食源性微生物的研究極少，亟須開展。

參考文獻

方中達．1996．植病研究方法．3版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社．

康玉凡，陶禮明，毛振賓，羅珊．2008．工廠化豆芽成為現(xiàn)代加工食品新寵．長江蔬菜，（9）：73-76．

李振華，段玉，康玉凡．2011．豆類芽菜生產(chǎn)工藝的研究進展．中國農(nóng)學(xué)通報，27（10）：76-81．

袁星星，陳新，陳華濤，崔曉艷，顧和平，張紅梅．2014．豆類芽菜生產(chǎn)技術(shù)研究現(xiàn)狀及發(fā)展方向．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（5）：136-139．

張麗，吳小剛，張力群，康玉凡，梁海榮．2010．豆芽爛芽的病原菌分離鑒定及致病性研究．長江蔬菜，（2）：71-74．

張麗，張立群，段會梅，康玉凡，呂玉蘭．2011．豆芽立枯病診斷與防治試驗．中國蔬菜，（4）：61-65．

Erickson M C．2012．Internalization of fresh produce by foodborne pathogens．Annual Review of Food Science and Technology，3：283-310．

Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，White T J．1990．PCR protocols：a guide to methods and applications．San Diego：Academic Press．

Isolation and Identification of Eight Microorganism Causing Sprout Disease

ZHANG An-hua1，CAI Xiang2，CHEN Tao3，WANG Ping1，ZHU Ju-hong1，ZHAO Zhi-yuan1
（1Institute of Crop Sciences，Wuhan Academy of Agriculture Science and Technology，Wuhan 430345，Hubei，China；2Wuhan Weierfu Biological Technology Co.，Ltd，Wuhan 430345，Hubei，China；3Hubei Weimin Biological Technology Co.，Ltd，Wuhan 430207，Hubei，China）

Abstract：Twenty-four bacteria and 8 fungi were isolated from 8 different kind industrial producing sprouts．Molecular identification showed that these 24 bacteria belong to 8 genus（Klebsiella，Enterobacter，Pseudomonas，Acinetobacter，Pectobacterium，Empedobacter，Delftia and Comamonas），and were all G-，and 7 of them were not typical plant pathogen，except Pectobacterium．Four genus（Acinetobacter，Enterobacter，Klebsiella and Pseudomonas）were isolated from 2 or over 2 sprouts，and the other 4 genus were only isolated from one kind sprout．The result implied that there was host specialization in these bacteria．Eight fungi belong to 3 genus（Fusarium，Alternaria and Rhizopus）．Fungi isolated from the other 6 sprouts all belong to Fusarium，Alternaria and Rhizopus fungi were only isolated from water spinach and radish sprout，respectively．The water spinach and radish sprouts showed different rot symptoms after inoculated by 4 bacteria，and the black soya bean sprouts showed different rot symptoms after inoculated by 3 fungi．These results indicated that microorganism from environment during production process could also cause sprout diseases．

Key words：Sprout；Microorganism；Bacteria；Fungi；Identification

收稿日期：2015-10-21；接受日期：2016-01-24

基金項目：武漢市科技局關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)項目（2014020202010135）