不同鉀水平下花魔芋差異表達基因分析

曾黎瓊韓蓉蓉，，段玉云陳　玲文亦芾李娥賢姜　飛，

（1云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南省農業生物技術重點實驗室，農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南昆明 650223；2云南農業大學動物科學技術學院，云南昆明 650201；3西南大學動物科技學院，重慶 400715）

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不同鉀水平下花魔芋差異表達基因分析

曾黎瓊1韓蓉蓉1，2，3段玉云1陳玲1文亦芾2李娥賢1姜飛1，2

（1云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南省農業生物技術重點實驗室，農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南昆明 650223；2云南農業大學動物科學技術學院，云南昆明 650201；3西南大學動物科技學院，重慶 400715）

摘 要：為了探索魔芋對不同水平鉀素營養的反應機制，提取施用低、中、高水平硫酸鉀5 d后的富源花魔芋葉片總RNA，合成了cDNA，采用優化的cDNA-SRAP技術體系分析了在低鉀、中鉀、高鉀水平下富源花魔芋葉片的差異表達基因，并對其進行了生物信息學分析。結果顯示：29對引物組合共擴增出507條基因片段，其中差異片段126條。相對于中鉀處理，低鉀、高鉀處理的差異片段包括抑制型表達片段19條，誘導型表達片段14條，上調表達型片段29條，下調表達型片段64條。選取表達量高的13條差異片段進行回收測序，并在NCBI上進行BLAST比對，共比對出9條差異片段的同源序列，其中4條與已知功能基因（谷氨酰胺酰-tRNA 合成酶、β-ATP合成酶、GTP結合蛋白、核苷酸還原酶）有較高同源性，5條與假定基因或預測基因同源性較高，剩余序列未找到同源序列，可能是一些新的魔芋與鉀營養吸收利用相關的基因，具體功能還有待于進一步研究。

關鍵詞：富源花魔芋；cDNA-SRAP；基因表達；鉀水平

曾黎瓊，女，研究員，專業方向：農作物生物技術，E-mail：liqiongzeng@sina.com

魔芋（Amorphophallus konjac）是天南星科魔芋屬多年生草本植物，球莖富含葡甘露聚糖，是我國重要的經濟作物，在食品、醫藥、環保、化工、建筑等領域有著廣泛的用途。富源花魔芋是云南魔芋生產中的主栽品種，段玉云等（2015）研究表明，富源花魔芋是一種喜鉀作物，對鉀素營養有較強的吸收能力，鉀素營養水平影響其產量和品質。

SRAP （sequence-related amplified polymorphism）即相關序列擴增多態性，該技術操作簡便、重復性好，近年來廣泛應用于植物遺傳多樣性分析、分子遺傳圖譜構建、重要性狀基因定位、親緣關系鑒定、分子標記輔助選育等方面（Yves et al．，2010；Muhammad et al．，2011；盧超 等，2014）。cDNASRAP技術目前已在甘蔗（吳建明 等，2010）、蠟梅（趙凱歌 等，2012）、棉花（陳沙沙 等，2013）、甘藍（張云霞 等，2014）等作物的基因表達分析中得到應用，成為了一種新的轉錄基因組學研究工具。本試驗以云南魔芋主栽品種富源花魔芋為材料，利用cDNA-SRAP技術研究在低鉀、高鉀脅迫下展葉期富源花魔芋基因表達差異性，為篩選和鑒定富源花魔芋鉀高效吸收利用基因、認識魔芋鉀營養吸收利用的分子機制以及魔芋的生物技術育種奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試富源花魔芋：采自云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所溫室，種植方式為盆栽。試驗藥劑：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、Marker DL 2000購于天根生化科技（北京）有限公司；dNTP、Taq聚合酶購于Thermo公司；引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他一般試劑為國產分析純。主要試驗儀器：離心機（Eppendorf 5417R），DNA擴增儀（Biometra Tprofessional PCR儀），電泳儀（北京六一DYY-6C型號），凝膠成像系統（Syngene GeneGenius），紫外分光光度計（Thermo NanoDrop 2000分光光度計）。

表1 引物序列

1.2試驗方法

試驗于2014年4月20日在云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所溫室中進行富源花魔芋盆栽種植，根據段玉云等（2015）對富源花魔芋不同時期植株含鉀量及其對鉀肥利用效率的分析研究結果，本試驗選擇在富源花魔芋生長（基質培）至展葉期時，澆施高（K2SO4施用量為6.6 g·株-1）、中（K2SO4施用量為4.4 g·株-1）、低（K2SO4施用量為2.2 g·株-1）不同水平硫酸鉀，每處理重復3次，每重復5株，5 d后每個處理分別采集5株植株復葉的中部葉片，液氮速凍后于-70 ℃保存。

1.2.1RNA的提取和cDNA的合成 采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取花魔芋葉片總RNA，利用超微紫外分光光度計測定RNA濃度，用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分析其純度；用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈。嚴格按照說明書進行操作。

1.2.2cDNA-SRAP反應體系的建立 采用單因素變量分析方法分別對cDNA用量、Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度和Taq酶用量進行cDNA-SRAP反應體系的優化，優化時選用ME4/EM4引物組合。在20 μL的反應體系中：cDNA用量梯度設為50、100、150、200 ng；Mg2+濃度梯度設為1.5、2.0、2.5、3.0 mmol·L-1；引物濃度梯度設為0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1；dNTP濃度梯度設為0.15、0.20、0.25、0.30 mmol·L-1；Taq酶用量分別為0.5、1.0 、1.5、2.0 U。cDNA-SRAP PCR擴增反應程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，33 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s 5個循環；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s 30個循環；最后72 ℃延伸5 min。反應結束后4 ℃保存，擴增產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3花魔芋差異表達基因的cDNA-SRAP分析

用優化的cDNA-SRAP反應體系對低鉀、中鉀、高鉀3個處理的富源花魔芋樣品進行分析。cDNASRAP PCR擴增反應程序同1.2.2。擴增產物采用6%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測。

1.2.4差異片段的克隆、測序分析 將差異片段從聚丙烯酰胺凝膠上切下回收，加入30 μL ddH2O，室溫放置24 h后取10 μL作為模板再次進行PCR擴增，所用引物和程序與最初反應相同。采用1%瓊脂糖凝膠檢測產物是否與原片斷大小相同，選取與原片段大小相同的目的條帶的PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2　結果與分析

2.1花魔芋RNA的質量和cDNA質量

花魔芋RNA的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示（圖1）：低鉀、中鉀、高鉀3種處理樣品的RNA 28S、18S帶型清晰整齊、完整性好，經測定RNA的OD260/280值均在1.8～2.0之間，說明提取的RNA純度高、質量好。

圖1 花魔芋RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

用cDNA第一鏈合成試劑盒合成了花魔芋cDNA第一鏈，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示：低鉀、中鉀、高鉀3種處理樣品在100～2 000 bp之間均有彌散帶，說明合成的cDNA質量好。

2.2花魔芋cDNA-SRAP反應體系的建立

根據單因素變量分析法優化cDNA-SRAP反應體系結果可知，花魔芋最佳的cDNA-SRAP反應體系（20 μL）為：cDNA模板用量150 ng，Mg2+濃度為2.0 mmol·L-1，引物濃度為0.3 μmol·L-1，dNTP濃度為0.25 mmol·L-1，Taq酶用量為1.0 U。

2.3不同鉀水平下花魔芋的差異表達基因分析

以低鉀、中鉀、高鉀3種處理樣品合成的cDNA為模板，用建立的最佳反應體系進行SRAPPCR擴增。如圖2所示，分別以ME4/EM3、ME4/EM4、ME4/EM5、ME4/EM6為引物，低鉀、中鉀、高鉀3種處理共擴增出差異條帶13條。試驗所用的29對引物組合共擴增出507條片段，其中差異片段126條。相對中鉀處理，低鉀、高鉀處理的差異片段包括抑制型表達片段19條，誘導型表達片段14條，上調表達型片段29條，下調表達型片段64條。

圖2 花魔芋cDNA-SRAP聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果

2.4差異表達基因片段的序列分析

選取條帶亮、表達量高的13條差異片段進行回收測序，測序結果在NCBI上進行BLAST同源性比對分析，共比對出9條差異片段的同源序列（表2），其中4條差異表達核苷酸序列與已知功能基因（谷氨酰胺酰-tRNA 合成酶、β-ATP合成酶、GTP結合蛋白、核苷酸還原酶）有較高同源性，5條序列與假定基因或預測基因同源性較高，剩余序列未找到同源序列，可能是一些新的魔芋與鉀營養相關基因，具體功能有待進一步研究。

表2 花魔芋差異表達基因片段的同源性分析

3　結論與討論

cDNA-SRAP是一種無需任何序列信息即可進行差異表達研究的新技術，通過一對引物對開放讀碼框（ORFs）進行擴增，正向引物為17個堿基，其中的CCGG序列目的是與位于富含GC區域的開放讀碼框中的外顯子進行特異結合；反向引物為18個堿基，其中的AATT序列可以對富含AT的內含子區域和啟動子區域進行擴增。SRAP產生共顯性標記的效率遠大于其他標記技術，而且步驟較少，操作相對簡單，成本較低，花費時間少。cDNA-SRAP技術在棉花（陳沙沙 等，2013）、甘蔗（吳建明 等，2010）、甘藍（張云霞 等，2014）、蠟梅（趙凱歌 等，2012）等作物基因表達分析中的應用，證明了此技術是行之有效的。

富源花魔芋是云南魔芋生產上的主栽品種。段玉云等（2015）的研究發現，展葉期富源花魔芋對適量鉀素營養有很好的吸收利用效率。施用適量鉀素營養有利于提高葉片葉綠素、可溶性蛋白和可溶性糖含量，增強了葉片SOD、 CAT、 POD活性，降低了魔芋葉片MDA含量，對魔芋抗氧化酶系統以及膜脂過氧化系統有一定的生理效果，增強了魔芋植株抵抗逆境和抗衰老的能力，進而影響了葉片的光合作用和同化產物的合成、轉化和運輸，從而獲得了魔芋的高產（待發表）。本試驗利用優化的cDNA-SRAP技術最終得到花魔芋最佳cDNA-SRAP反應體系（20 μL）：cDNA模板150 ng、Mg2+濃度為2.0 mmol·L-1、引物濃度0.3 μmol·L-1、dNTP濃度0.25 mmol·L-1、Taq酶用量1.0 U，并初步分析了展葉期施用不同量硫酸鉀5 d后富源花魔芋葉片的差異表達基因，表明不同鉀水平下富源花魔芋的基因表達存在差異，這些差異表達基因的具體功能有待于進一步分析研究。

下一步可以通過與轉錄組測序等分析結果的比較篩選以及生物信息學的分析研究，結合RTPCR、RACE等技術對得到的新候選基因轉錄本進行時空表達研究和全長序列克隆，為認識魔芋鉀吸收利用的分子機制和魔芋鉀高效吸收利用基因的發掘奠定基礎。

參考文獻

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段玉云，董坤，王片吉，謝勇，李萍仙，盧俊，李勝，曾黎瓊，潘開華．2015．富源花魔芋對不同硝酸鉀施用量的吸收利用．西南農業學報， 28（4）：1697-1701．

盧超，張美德，何銀生，劉海華，艾倫強．2014．SRAP技術在植物遺傳育種中的應用．現代農業科技，（16）：18-20．

吳建明，李楊瑞，王愛勤，楊柳，楊麗濤．2010．利用cDNASRAP分析赤霉素誘導甘蔗節間伸長的差異表達．中國農業科學，43（19）：3937-3944．

張云霞，宋立曉，曾愛松，高兵，嚴繼勇．2014．利用cDNASRAP分離結球甘藍抗黑腐病相關基因的研究．華北農學報，29（5）：29-32．

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Muhammad Y，Andrew C J，Renata R M．2011．Musa genetic diversity revealed by SRAP and AFLP．Molecular Biotechnology，47（3）：189-199．

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Differential Genes Expression Analysis of Amorphophallus konjac Plants Growing under Different Potassium Levels

ZENG Li-qiong1，HAN Rong-rong1，2，3，DUAN Yu-yun1，CHEN Ling1，WEN Yi-fu2，LI E-xian1，JIANG Fei1，2
（1Biotechnology & Germplasm Resources Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Key Lab of Agricultural Biotechnology of Yunnan Province，Key Lab of Southwestern Crop Gene Resource and Germplasm Innovation，Ministry of Agriculture，Kunming 650223，Yunnan，China；2College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，Yunnan，China；3College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Abstract：In order to investigate the response mechanism of Amorphophallus konjac plants growing under different potassium levels，the total RNA of the leaves of Amorphophallus konjac Fuyuan on the fifth day after potassium sulfate（low，medium and high level）was applied．Then cDNA was synthesized，and the differentially expressed genes of Amorphophallus konjac Fuyuan leaves under low，medium and high potassium sulfate were amplified by optimized cDNA-SRAP，and their bioinformatics was analyzed．The results showed that 507 gene segments were amplified by 29 pairs primer combinations，including 126 differentially expressed gene segments．Compared with the medium potassium level，19 inhibited expressed fragments，14 induced expressed fragments，29 up-regulated expressed fragments，and 64 down-regulated expressed fragments were found in the low and high potassium levels．After recycling 13 differentially expressed gene segments of good quantity，9 homologous sequences matched with them in NCBI．Except for 4 nucleotide sequences matching with higher homology to the known function genes (glutaminyl-tRNA synthetase，β-ATP synthase，YchFGTP-binding protein YchF，ribonucleotide reductase) and 5 nucleotide sequences matching with higher homology to the assumption genes or the predict genes，other differentially expressed gene segments were not found，which might be some new genes of Amorphophallus konjac Fuyuan associated with potassium nutrition uptake．The specific function of the new genes will be further studied and analyzed in the future．

Key words：Amorphophallus konjac Fuyuan；cDNA-SRAP；Gene expression；Potassium level

收稿日期：2015-10-14；接受日期：2016-02-26