警惕煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒病在我國快速擴散

鄭慧新夏吉星周小毛張友軍*

（1湖南農業(yè)大學農藥研究所，湖南長沙410128；2中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

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警惕煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒病在我國快速擴散

鄭慧新1，2夏吉星2周小毛1張友軍2*

（1湖南農業(yè)大學農藥研究所，湖南長沙410128；2中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

摘 要：2013～2014年連續(xù)兩年對我國番茄主產區(qū)煙粉虱攜帶番茄褪綠病毒（ToCV）的情況進行了監(jiān)測。結果發(fā)現，在2013年全國采集的16個地區(qū)煙粉虱樣本中，山西運城、山西太原、山東商河、陜西楊凌、北京海淀5個地區(qū)煙粉虱攜帶ToCV，煙粉虱樣品攜帶ToCV的帶毒率均低于20%；在2014年全國采集的17個地區(qū)煙粉虱樣本中，北京海淀、浙江杭州、山東商河、山西運城、陜西楊凌、內蒙古等6個地區(qū)的煙粉虱攜帶ToCV，且除北京外帶毒率均大于50%。山西、陜西、浙江、內蒙古地區(qū)ToCV的發(fā)生均為首次報道，且2014年煙粉虱田間種群帶毒率明顯高于2013年。番茄褪綠病毒病的快速擴散趨勢需引起高度重視。

關鍵詞：煙粉虱；番茄褪綠病毒；檢測

鄭慧新，女，碩士研究生，專業(yè)方向：昆蟲毒理學，E-mail：zhenghx0124@163.com

番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）是我國新報道的對番茄、辣椒等茄科蔬菜造成毀滅性危害的RNA病毒，屬長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus）。ToCV侵入植株初期，癥狀表現不明顯，隨后葉脈間發(fā)黃褪綠，顏色加深，葉片變厚、邊緣卷曲變脆，發(fā)病由老葉向新葉發(fā)展，造成植株發(fā)育受阻，果實減產（Wintermantel & Wisler，2006）。該病毒寄主廣泛，不僅侵染番茄、辣椒、甜椒等茄科植物，還能侵染莧科、番杏科、藜科、夾竹桃科、菊科和白花丹科等7科植物（Wintermantel & Wisler，2006）。ToCV發(fā)病率高且傳播速度快，據報道，發(fā)病溫室內感染ToCV的病株率為20%～100%，感病植株減產10%～40%，造成果實商品性下降，給種植戶造成巨大的經濟損失（劉永光 等，2014）。1998年美國佛羅里達州首次發(fā)現ToCV（Wisleret et al.， 1998b），隨后該病毒在全球范圍內迅速擴散，目前已在北美洲（Wintermantel et al.，2001； Alvarez-Ruiz et al.，2007；Castro et al.，2009； Sundaraj et al.，2011）、南美洲（Barbosa et al.，2008；Arruabarrena et al.，2014）、歐洲（Louro et al.，2000；Dalmon et al.，2005； Lozano et al.，2006；Papayiannis et al.，2006； Parrella & Scassillo，2006； Bese et al.，2011 ）、非洲（Lett et al.，2009； Fiallo-Olivé et al.，2011）和亞洲（Segev et al.，2004； Abou-Jawdah et al.，2006； ?evik & Erk??，2008）等多個地區(qū)發(fā)生，我國于2012年在北京首次檢測出ToCV（Zhao et al.，2013）。

ToCV只能依靠媒介昆蟲傳播，主要媒介昆蟲是煙粉虱（Bemisia tabaci）、溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）和紋翅粉虱（Trialeurodes abutilonea）（Wisler et al.，1998a）。煙粉虱是世界性入侵害蟲，可以傳播至少200種植物病毒病。煙粉虱體型小，繁殖速度快，寄主廣泛，只要煙粉虱攜帶ToCV，當地作物就更易受到侵染。因此，檢測煙粉虱攜帶ToCV的情況，是了解采集地區(qū)番茄帶毒情況及ToCV發(fā)生規(guī)律快速而有效的方法，有助于根據煙粉虱的發(fā)生和帶毒情況采取合理的防治措施，控制ToCV的暴發(fā)。

本試驗采集了2013～2014年全國部分地區(qū)番茄植株上的煙粉虱樣本，通過RNA提取和PCR檢測，鑒定該地區(qū)采集的煙粉虱樣本是否帶毒，檢測帶毒地區(qū)煙粉虱帶毒率。通過對比2013年與2014年煙粉虱攜帶ToCV的情況，明確其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為我國ToCV的綜合防控提供科學指導。

1　材料與方法

1.1煙粉虱樣本的采集

2013～2014年在山西運城、山西太原、山東商河、陜西楊凌、北京海淀、遼寧沈陽、河北廊坊、江蘇揚州、河北保定、新疆烏魯木齊、內蒙古、黑龍江哈爾濱、江西南昌、上海、湖南長沙、浙江杭州、海南海口、山東青島、安徽、天津西青、云南元謀、河南、廣東廣州、江西南昌、四川自貢等地區(qū)采集番茄植株上的煙粉虱成蟲樣本，各地采集樣本數量均為300個（表1）。采集到的樣本置于95%的乙醇中，-20 ℃保存。

1.2煙粉虱的RNA提取

從各地區(qū)采集的樣本中隨機選取12頭煙粉虱進行多頭煙粉虱的RNA提取，以明確各地區(qū)采集的煙粉虱樣本是否帶毒；確定煙粉虱樣本帶毒后，隨機提取該地區(qū)單頭煙粉虱RNA，計算各地區(qū)煙粉虱樣本的帶毒率。

利用Trizol法提取煙粉虱RNA。取煙粉虱樣本置于1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol，用研磨棒充分研磨蟲體，室溫放置4 min；加入200 μL氯仿，漩渦振蕩30 s，室溫放置3 min，4 ℃下12 000 rpm離心15 min，再將上清液轉入新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，輕輕混勻之后，置于冰上10 min，4 ℃下12 000 rpm離心10 min；棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次，自然風干后，溶于7 μL RNase-free水，測定A260/A280值并確定總RNA的含量和純度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€地區(qū)3次重復。

1.3cDNA合成

反轉錄使用TaKaRa in PrimerSprit?RT Reagent Kit，按照說明書進行操作。取1 μL總RNA（單頭檢測取7 μL），加入1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，補充RNase-free水至總體積為10 μL，42 ℃溫浴2 min，之后加入4 μL RNase-free水，4 μL 5×PrimerSprit?Buffer 2，1 μL RT Primer Mix，1 μL PrimerSprit?RT EnzymeMixⅠ，輕輕混勻，37 ℃溫浴15 min，85 ℃ 5 s終止反應，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR擴增和電泳檢測

采用ToCV特異性引物ToCV-172（+）（5′-GCTTCCGAAACTCCGTCTTG-3′）和ToCV-610（?）（5′-TGTCGAAAGTACCGCCACC-3′）進行PCR擴增（Louro et al.，2000）。PCR反應體系為：La Taq 0.2 μL，LA Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1.5 μL，加水至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。

1.5煙粉虱帶毒率檢測

隨機選取36頭煙粉虱進行帶毒率檢測，3次重復，每次12頭，計算煙粉虱平均帶毒率。

煙粉虱帶毒率=攜帶ToCV的煙粉虱數目/檢測煙粉虱數目×100%

2　結果與分析

2.1樣品檢測

圖1 煙粉虱體內ToCV的RT-PCR檢測結果

采集北京海淀地區(qū)疑似感染ToCV番茄植株上的煙粉虱樣本進行檢測，提取煙粉虱RNA，以反轉錄的cDNA為模板，利用ToCV特異性引物ToCV-172和ToCV-610進行PCR擴增（圖1）。產物測序后通過NCBI進行比對，產物序列與ToCV序列的相似性最高達到97%，表明北京海淀地區(qū)的樣本感染了ToCV病毒。以北京海淀地區(qū)攜帶ToCV的煙粉虱樣本為陽性對照，實驗室健康番茄植株上采集的煙粉虱樣本為陰性對照，檢測采集煙粉虱樣本的帶毒情況（圖1）。

2.2煙粉虱帶毒情況檢測

試驗結果表明（表1），2013年采集自北京海淀、山西太原、山西運城、山東商河及陜西楊凌5個地區(qū)的煙粉虱樣品攜帶ToCV；2014年北京海淀、山西運城、陜西楊凌、浙江杭州、山東商河和內蒙古6個地區(qū)采集的煙粉虱樣品攜帶ToCV（圖2）。浙江杭州、內蒙古等2013年并未發(fā)現煙粉虱攜帶病毒的地區(qū)，在2014年檢測到ToCV的發(fā)生。山西、陜西、浙江及內蒙古4個地區(qū)采集的煙粉虱樣本攜帶ToCV為首次報道。

2.3煙粉虱帶毒率檢測

對帶毒地區(qū)的煙粉虱樣本進行單頭煙粉虱帶毒情況檢測，計算樣品帶毒率。檢測結果表明（表2，圖3），2013年各地區(qū)煙粉虱樣品ToCV的帶毒率均低于20%，2014年煙粉虱樣品帶毒率與2013年相比明顯增加，除北京地區(qū)外，各地區(qū)煙粉虱樣品帶毒率均超過50%。新報道的山西、陜西、浙江及內蒙古4個地區(qū)，單頭煙粉虱帶毒率也明顯增加。

表1 煙粉虱采集地區(qū)及多頭煙粉虱帶毒情況

圖2 2014年各地區(qū)煙粉虱帶毒情況檢測

3　結論與討論

ToCV能造成番茄植株發(fā)育受阻，使其減產，造成重大的經濟損失。ToCV發(fā)病前期癥狀不明顯，發(fā)現癥狀時，病毒可能借由煙粉虱等媒介昆蟲傳播到其他植株上，隨即造成ToCV的大范圍暴發(fā)。因此，對煙粉虱攜帶ToCV情況的監(jiān)測有利于預防和控制該病毒的發(fā)生，減少其帶來的危害。

表2 2013～2014年單頭煙粉虱帶毒率

圖3 2014年山東商河地區(qū)煙粉虱帶毒率檢測

本試驗通過檢測2013～2014年各地采集的煙粉虱樣本攜帶ToCV的情況，監(jiān)測全國ToCV的發(fā)生情況。研究結果表明，我國煙粉虱攜帶ToCV的地區(qū)除已報道的北京、江蘇、山東之外（Zhao et al.，2013；Karwitha et al.，2014，；Zhao et al.，2014），新增了山西、陜西、浙江及內蒙古4個地區(qū)；2013年各地區(qū)煙粉虱帶毒率均不超過20%，2014年煙粉虱帶毒率除北京地區(qū)外，其他地區(qū)均超過50%。在新檢測到ToCV的地區(qū)中，山西及陜西地區(qū)煙粉虱帶毒率由2013年的低于20%急速上升到2014年的超過75%，浙江及內蒙古在2014年首次檢測的帶毒率均高于50%。由此可見，我國ToCV的發(fā)生正以北京、山西、山東為中心，迅速擴展，且發(fā)病率高，給我國番茄生產帶來了巨大威脅。

ToCV是RNA病毒，主要媒介昆蟲煙粉虱的傳播方式為半持久性傳播，因此，在采集樣本時，病毒可能已經降解或未保留在煙粉虱體內，同時由于采集時間和采集地點等其他因素的影響，不排除已發(fā)生ToCV地區(qū)采集的煙粉虱樣品未檢出該病毒或帶毒率低的情況。因此，今后需要對全國煙粉虱攜帶ToCV進行更加全面的檢測，才能為防控ToCV的流行和傳播提供科學指導。

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Be on Alert of Rapid Diffusion of Tomato chlorosis virus Transmitted by Whitefly in China

ZHENG Hui-xin1，2，XIA Ji-xing2，ZHOU Xiao-mao1，ZHANG You-jun2*
（1Institute of Pesticide Science，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：In this study，we monitored the carrying rate of ToCV of Bemisia tabaci in major tomato production areas of China in 2013 and 2014．We discovered that in 2013，among all B. tabaci samples collected from 16 different areas of China，those from Yuncheng Shanxi，Taiyuan Shanxi，Shanghe Shandong，Yangling Shaanxi，Haidian Beijing carried ToCV，but the virus carrying rates were all below 20%．In 2014，among B. tabaci collected from 17 areas，those from Haidian Beijing，Hangzhou Zhejiang，Shanghe Shandong，Yuncheng Shanxi，Yangling Shaanxi，and Inner Mongolia were infected by ToCV．The virus carrying rates，except Beijing，were all above 50%．ToCV was reported for the first time in Shanxi，Shaanxi，Zhejiang and Inner Mongolia，and the rate of ToCV-infected B. tabaci increased significantly in 2014，compared with that in 2013．Thus，high attention should be paid to the trend of ToCV rapid diffusion in China.

Key words：Bemisia tabaci；Tomato chlorosis virus；Detection

*通訊作者（

Corresponding author）：張友軍，男，研究員，博士生導師，專業(yè)方向：蔬菜害蟲分子生物學、生態(tài)學，害蟲抗藥性機理和害蟲綜合防治，E-mail：zhangyj@mail.caas.net.cn

收稿日期：2015-09-01；接受日期：2015-10-19

基金項目：國家科技支撐計劃項目（2012BAD19B01）；蔬菜有害生物控制與優(yōu)質栽培北京市重點實驗室項目