新城疫病毒HN基因的克隆及在苜蓿中的表達

楊紅軍,王豪舉

(1.西南大學資源環境學院,重慶北碚 400715;2.西南大學動物科技學院,重慶北碚 400715）

雞新城疫(ND）1926年首次在印度尼西亞的爪哇和英國的紐卡斯爾艾佛頓暴發。該病是由新城疫病毒(NDV）引起的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型病變的高度接觸性、急性敗血性禽類傳染病。ND的預防目前采用滅活苗和弱毒苗接種,但它干擾流行病學調查和監測,不利于控制ND的流行和傳播。也使應用受到限制,但在世界范圍內仍是危害養雞業的重要傳染病之一[1]。

轉基因植物疫苗(transgenic p lant vaccine）是把植物基因工程技術與動物機體免疫機理相結合,生產出能使動物機體獲得特異抗病能力的疫苗[2]。動物試驗已經證實,轉基因植物表達的抗原蛋白經純化后仍保留了免疫學活性,注入動物體后能產生特異性抗體;用轉基因植物組織飼喂動物,轉基因植物表達的抗原呈遞到動物的腸道淋巴相關組織,被其表面特異受體特別是M細胞所識別,產生黏膜和體液免疫反應[3-9]。

本試驗通過 RT-PCR獲得新城疫病毒LaSota株血凝素-神經氨酸苷酶(HN）基因,定向克隆到植物表達載體pBI121中,構建了含有LaSota株HN基因的表達重組質粒 pBI121-HN,并通過 SDSPAGE對其在苜蓿中表達進行了初步的探討,為利用植物作為生物反應器奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒及NDV標準陽性血清,購自中國獸醫藥品監察所;pMD-18-T載體和大腸桿菌DH 5α購自寶生物工程(大連）有限公司;AMV 反轉錄酶和RNase抑制劑RNasin,購自Promega公司;質粒pBI121及根癌農桿菌LBA 4404由西南農業大學生物工程中心惠贈。

1.2 病毒的增殖與純化 將NDV LaSota株接種于20枚9日齡雞胚,37℃孵育,無菌收取尿囊液。并測尿囊液血凝效價[11]。蔗糖密度梯度離心法純化病毒,-70℃保存備用。

1.3 新城疫HN基因的擴增 參照GenBank中的NDV HN(AF077761）基因高變區核苷酸序列,設計合成1對引物(P1:5′-atgaccaaaggacgatatacggg-3′和 P2:5′-cgccatgtcctacccgtattatt-3′）,引物由寶生物工程(大連）有限公司合成。病毒基因組 RNA用TRIAZOL RNA提取試劑盒,按說明書進行提取;反轉錄按Promega公司AMV反轉錄酶說明書進行。

1.4 HN基因的克隆和測序鑒定 將PCR產物經過回收后,與PMD-18-T載體進行 T-A克隆,連結產物轉化大腸桿菌DH5α,經酶切鑒定得到陽性克隆。重組質粒pMD-18-T-HN核苷酸序列由寶生物工程(大連）有限公司測定。

1.5 重組表達質粒pBI121-HN的構建和鑒定 根據HN基因的下游序列設計 1條引物,P3:5′-agagctcgccttgtatctcattgccacttac-3′,由 寶生 物工 程(大連）有限公司合成,并引入 SacⅠ酶酶切位點;與通用引物M13,以pMD-18-T-HN為模板,擴增HN基因,經XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后,定向克隆入表達質粒 pBI121的相應位點,構建重組表達質粒pBI121-HN,經酶切和測序鑒定。

1.6 重組表達質粒pBI121-HN轉化根癌農桿菌,并在苜蓿中的表達 用電穿孔法將重組表達質粒pBI121-HN轉化到根癌農桿菌LBA 4404感受態細胞中,得到陽性克隆后,帶有重組表達質粒pBI121-HN的根癌農桿菌侵染苜蓿愈傷組織,將H N基因轉入苜蓿中,對再生植株提取總蛋白質,SDS-PAGE電泳后進行銀染,以及Western-blot分析。

2 結果

2.1 病毒的分離與鑒定 病毒接種雞胚后,24 h內死亡2枚(棄掉）,72 h內死亡5枚,96 h死亡8枚,5枚未死,置冰箱凍死。尿囊液血凝價在1∶26～1∶211之間,且血凝性能被NDV標準陽性血清抑制。

2.2 HN基因的 RT-PCR擴增和克隆 用 TRIZOL試劑盒提取新城疫 LaSota株病毒基因組RNA,經反轉錄合成第一cDNA,以P1和P2為引物,經PCR擴增出大小為2083 bp的片段(圖1）,與預期的片段長度相符,將PCR產物純化回收后,按常規方法與pMD-18-T連結轉化,經XbaⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定重組質粒(圖2）,挑取陽性克隆與進行測序鑒定,測序結果表明,擴增出2 083 bp的核苷酸中包含HN基因的完整閱讀框,核苷酸序列同源性達99%,氨基酸序列有2個氨基酸存在差異,均為點突變,對抗原結構影響不大。

2.3 重組表達質粒pBI121-HN的構建和鑒定 重組表達質粒pBI121-HN經XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后電泳,出現2 083bb的插入片段和2.9 kb的載體條帶,與預期結果相符(圖3）,結果表明,HN基因已被正確插入表達載體pBI121中。

圖3 pBI121-HN酶切鑒定結果

2.4 重組表達質粒pBI121-HN,在苜蓿中的表達

將鑒定正確的重組質粒pBI121-HN經電穿孔法轉化根癌農桿菌感受細胞LBA 4404,篩選陽性克隆,侵染苜蓿組織。對5株再生植株提取總蛋白質,經SDS-PAGE電泳檢測,3#、10#、15#和 34#共 4株在蛋白質分子量64 kD處出現一條帶,與預期的目的蛋白質大小相符,而對照苜蓿和20#植株沒有出現條帶(圖4）,以NDV多抗血清為一抗,H RP標記的羊抗鼠IgG為二抗,進行Western-b lot分析,結果在64 kD處出現條帶(圖5）,初步判定HN基因在苜蓿中已經表達。

圖4 苜蓿蛋白質SDS-PAGE結果

3 討論

對于新城疫這種烈性傳染病來說,用疫苗預防接種是首選方法。但傳統的疫苗接種往往受宿主和病毒兩方面的影響而使得免疫失敗,即宿主對病毒的免疫耐受力下降及病毒產生變異使宿主不能抵抗病毒的攻擊。1992年,Mason H S等[10]提出了用轉基因植物生產疫苗的新思路,從而開辟了一條用植物生產可食用疫苗的新途徑。其中利用苜蓿表達系統表達動物病原蛋白成本低、蛋白質能夠正確折疊、具有口服安全等特點,備受國內外研究人員的廣泛關注,到目前為止,人們應用轉基因苜蓿作為表達病原抗原蛋白的異源表達載體,成功地表達了多種外源蛋白質[11]。

本文表達載體pBI121-HN是將外源基因功能基因HN基因插入 Ti質粒中,質粒的CaMV 35S啟動子是組成型啟動子,可以啟動外源基因在植物染色體上的表達,HN基因自身帶有ATG啟始密碼子和TGA終止密碼子,通過檢測新霉素磷酸轉移酶(NPTⅡ）的正常表達,說明HN基因的插入并未破壞基因讀碼框,也可初步預測HN基因在植物染色體上的成功表達,因而構建的pBI121-HN是一個有效的植物雙元表達載體系統。

通過苜蓿蛋白質SDS-PAGE結果初步判定雞新城疫HN基因在苜蓿中已經表達。利用植物作為載體來表達和傳遞疫苗的發展給免疫研究注入了新的內容,在21世紀這個生物技術的世紀里,苜蓿作為傳統的重要牧草應用于轉基因植物疫苗的生產,展示出了良好的應用前景。

圖5 Western-blot檢測苜蓿中HN蛋白質的表達

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