兔多殺性巴氏桿菌的分離與PCR鑒定

苗立中 ,李 峰,王 艷,李書光,謝金文,沈志強

(山東省濱州畜牧獸醫研究院,山東濱州 256600）

兔巴氏桿菌病(又稱兔出血性敗血癥）,是由多殺性巴氏桿菌引起的急性、致死性傳染病。兔巴氏桿菌病臨床上以出現鼻炎、地方流行性肺炎、全身性敗血癥、中耳炎、結膜炎、子宮積膿和睪丸炎等特征。本病發生后多呈散發性,因此難以凈化兔群,如不及時采取有效措施會引起家兔生長緩慢、飼料報酬降低或大批死亡及藥物防治費用增加,給養兔業造成嚴重的經濟損失。2010年3月山東淄博某兔場養殖的種兔和肉兔,出現急性死亡,經本院獸醫診斷中心對病死兔進行病原分離與鑒定,證實為兔多殺性巴氏桿菌引起。

1 發病情況及病理變化

發病兔場存欄兔856只,其中成年兔532只,小兔324只。發病期間病兔156只,發病率18.2%;發病死亡83只,其中小兔26只。部分兔未發現任何癥狀即突然死亡。

大多數病兔表現精神沉郁,行動遲緩,被毛零亂,有的食欲減弱或不食,鼻端被毛潮濕、纏結,眼結膜、鼻腔黏膜充血、出血,鼻腔有黏液流出,呼吸急促、困難,用前爪抓擦外鼻孔。腹瀉,排綠色稀糞,體溫40.7℃～42.2℃,一般發病后1～3 d死亡;病程稍長的,可見病兔四肢關節腫脹,行動不便。

剖檢死兔,可見腹膜、皮下組織有小點出血;喉氣管有點狀出血;心包膜有出血斑點;肺呈多發性肺炎,有氣腫出血;肝臟腫大、質脆、棕黃色,表面有出血點;脂肪變性;脾臟、腎臟腫大、出血;胃腸道出血,小腸出血嚴重,十二指腸呈卡他性出血性腸炎,腸系膜出血;淋巴結腫大、出血。

2 實驗室常規分離及分子生物學診斷

2.1 材料

2.1.2 試驗藥品 麥康凱瓊脂,購自北京雙旋微生物培養基制品廠;瓊脂粉,購自中國惠興生化試劑有限公司;馬丁肉湯培養基、鮮血瓊脂培養基及生化試劑,均按常規方法制備。生化管均購自杭州天和微生物試劑有限公司。藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司。

2.1.3 實驗動物 小鼠體重18～22 g,購自山東中醫藥大學動物實驗中心。實驗兔體重3.0～3.5 kg由山東綠都生物科技有限公司實驗動物中心提供。

2.1.4 受試菌液的制備 分離菌株純化后接種于5.0m L馬丁肉湯,37℃培養20 h,活菌計數后,調整菌液濃度,使其達到1×109CFU/m L作為感染試驗用菌液。

2.2 方法

2.2.1 病料涂片鏡檢 無菌采取兔的心血、肝臟和脾臟組織,干燥固定后分別做革蘭染色和瑞氏染色,然后鏡檢觀察。

2.2.2 病原分離培養及純化 無菌取肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結、腦組織和鼻內分泌物分別接種于鮮血瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基平板上[2],37℃培養48 h,從鮮血瓊脂培養基挑取單個典型菌落再次接種于該培養基上進行培養48 h;再次挑取單個典型菌落,將其一半接種到鮮血瓊脂斜面上進行純培養,同時將另一半菌落涂片、革蘭染色、鏡檢;純培養物置4℃冰箱中保存,備用。

2.2.3 生化試驗 從4℃冰箱內取出2株疑似巴氏桿菌分離株和標準菌株純培養物,在超凈臺內分別挑取單菌落穿刺接種葡萄糖、蔗糖、乳糖等生化管內,相同的生化管接種 3管,用封口膜封口,放入37℃恒溫培養箱中培養72 h觀察結果。

2.2.4 致病性及動物回歸試驗 取健康小鼠12只,隨機分成 3組,Zp1、Zp2為試驗組,Zp3為對照組。3組小鼠各皮下注射相應的菌株肉湯培養物0.2m L/只(1.0×109CFU/m L）,觀察小鼠死亡情況,死亡小鼠進行剖檢,觀察組織病變;采其心血涂片、染色、鏡檢,同時采集肝臟、脾臟、肺臟進行細菌分離培養。

自四川建立首臺高壓氧艙、開設新學科以來已有39年，39年在歷史的長河中彈指一揮間，但對一門交叉學科而言，從建立到發展，卻是一段跋涉與攀登的歷程，反映了一代人的堅持與努力。值此四川省醫學會90周年華誕之際，我們自豪地說：在推動現代醫學的發展浪潮中，四川省的高壓氧醫務人員做為一個團結進取、善于探索、勇于實踐的學術群體，對四川和全國醫學事業的發展做出了特殊貢獻。讓我們繼續攜手同行，用我們的智慧和雙手為當代中國高壓氧醫學譜寫新的篇章。

家兔回歸試驗:取16只健康家兔隨機分為4組,在腿部做好標記。兩組試驗組家兔接種分離菌株純化物Zp1和Zp2,標準對照組接種Zp3株,頸部皮下,2m L/只(1.0×1010CFU/m L）;陰性對照組注射等量生理鹽水,4組家兔相同條件飼養。接種后48 h內每8 h測體溫1次,并記錄。對死亡家兔進行剖檢,取其心血涂片、染色、鏡檢,同時采集死亡兔肝臟、脾臟、肺臟進行細菌分離培養。

2.2.5 藥敏試驗 按常規方法進行藥敏試驗。判定標準為抑菌環直徑在15 mm以上為高度敏感(青霉素高敏為20mm以上）;10～15mm為中度敏感;10 mm以下為低度敏感;無抑菌環為不敏感。

2.2.6 PCR鑒定 上游引物 P1:5′-ATCCGCTATTYACCCAGTGG-3′。下游引物 P2:5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′。

純培養的單個菌落接種于馬丁肉湯,37℃搖床培養16 h,煮沸法提取DNA。

PCR擴增反應體系(25μL）:滅菌去離子水17μL,10×Bu ffer 2.5μL,10mmo l/L dNTP 2μL,10 pmol/μL 上 、下游引物各1μL,模板1μL,Taq酶(5 U/μL）0.5μL。反應條件:95℃預變性5m in、94 ℃變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min,30個循環。PCR產物1%瓊脂糖電泳,凝膠成像儀觀察結果。

3 結果

3.1 細菌涂片鏡檢 將病料涂片,分別用革蘭染色和瑞氏染色后顯微鏡下觀察,瑞氏染色的涂片可見兩極著色明顯的球桿菌,兩極之間兩側連線明顯,革蘭染色為陰性、兩端著色較深的單個或成對的球桿菌。

3.2 細菌分離培養結果 將病料分別接種于鮮血瓊脂培養基平板、麥康凱瓊脂培養基平板,置于37℃恒溫箱中培養48 h后觀察,可見鮮血瓊脂培養基上菌落為圓形隆起、光滑濕潤、邊緣整齊、淺灰色、半透明、直徑為2～3 mm,在折光檢驗時呈現藍綠色;麥康凱瓊脂平板無菌生長。取典型菌落涂片,經革蘭染色及瑞氏染色后鏡檢,可見球桿菌。

3.3 生化試驗結果 見表1。

生化試驗結果如表1所示,符合多殺性巴氏桿菌的生化特性。3.4 致病性試驗結果 Zp1株、Zp2株、Zp3株3組小鼠均在接種后48 h內全部死亡。剖檢死亡小鼠,3株菌在接種局部均可見肌肉及皮下組織水腫和炎癥,胸腔和心包有漿液性纖維素滲出物,心外膜有多數出血點,肝臟、淋巴結水腫增大,取肺臟、肝臟等病變組織涂片,瑞氏染色鏡檢發現兩極濃染的球桿菌;革蘭染色鏡檢為兩極濃染的陰性球桿菌,符合多殺性巴氏桿菌的形態特性。

表1 3株菌的生化試驗結果

家兔回歸試驗兩試驗組及標準對照組家兔于48 h內全部死亡,死前精神委靡,呆立不動,食欲減退,呼吸困難,體溫升高;陰性對照組家兔均健活,無任何臨床癥狀。立即剖檢死亡家兔,可見其心外膜、呼吸道黏膜、肺臟、淋巴結有出血斑點。用心血涂片、革蘭染色、鏡檢,顯為陰性球桿菌。

3.5 藥敏試驗結果 兩分離菌株各種藥物抑菌圈的大小基本一致,參照前述藥敏試驗判定標準可知,頭孢噻呋、環丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考和磺胺六甲氧嘧啶對分離菌Zp1、Zp2有較好的藥物敏感性,多西環素、卡那霉素、紅霉素、新霉素中敏;青霉素、鏈霉素、土霉素、四環素低敏。

3.6 菌落PCR鑒定結果 擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離后,通過凝膠成像系統顯示結果如圖1,在457 bp處有一條亮帶,為目的條帶,證明PCR擴增成功。

圖1 菌落PCR鑒定的電泳結果

4 討論

4.1 根據流行病學調查、臨床表現、病理變化、分離菌株形態染色鏡檢觀察、培養特性、生化特性、致病性試驗、PCR鑒定等結果,可以確定所分離的菌株為兔多殺性巴氏桿菌。

4.2 從藥敏試驗的結果來看,此兔群分離的多殺性巴氏桿菌的耐藥性較強,14種抗生素中只有5種高敏,可能與臨床中不合理使用抗生素有關。此兔群經頭孢噻呋、氟苯尼考等高敏藥物治療,同時采用相應綜合防制措施,治療效果顯著,病情得到了控制。4.3 兔多殺性巴氏桿菌PCR鑒定方法,(本試驗采取從純培養物中進行檢測）,大大縮短檢測時間,能夠快速診斷疫病,對于盡快采取防制措施有重要的實踐意義。