褪黑素受體1B基因單核苷酸多態性與多囊卵巢綜合征的關系

楊金芳*，楊海美，程志娟（. 濱州市人民醫院婦產科，山東　濱州　56600；. 陽信縣人民醫院婦產科，山東　濱州　56600）

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褪黑素受體1B基因單核苷酸多態性與多囊卵巢綜合征的關系

楊金芳1*，楊海美1，程志娟2
（1. 濱州市人民醫院婦產科，山東濱州256600；2. 陽信縣人民醫院婦產科，山東濱州256600）

【摘要】目的 探討褪黑素受體1B（MTNR1B）基因單核苷酸多態性與多囊卵巢綜合征（Polycystie ovary syndrome，PCOS）發病的關系，以及與PCOS臨床特征、內分泌水平及血糖水平之間的關系。方法 應用聚合酶鏈反應-基因直接測序法，對182例PCOS不孕患者及196例因輸卵管因素或男方因素不孕的患者，進行MTNR1B基因的rs10830963多態性檢測，同時測定基礎狀態下的相關激素水平及空腹血糖。結果 （1）三種基因型及等位基因頻率在兩組之間的分布，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（2）在PCOS組中，SNP rsl0830963位點不同基因型婦女的空腹血糖水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），BMI、體重、及激素水平，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 MTNR1B基因多態性與PCOS的發病相關，rs10830963位點可能是其易感位點，且與PCOS患者空腹血糖水平有一定關系。

【關鍵詞】褪黑素受體；單核苷酸多態性；多囊卵巢綜合征

PCOS起病多見于青春期，為最常見的內分泌紊亂性疾病。以雄激素過高的臨床或生化表現、持續無排卵、卵巢多囊樣改變為特征，常伴有胰島素抵抗和肥胖，已影響到5%-10%［1］的育齡期婦女，在不排卵性不孕癥中占50%～70%，約20%的PCOS患者需要輔助生殖技術助孕。目前越來越多的研究證明PCOS是一種具有明顯遺傳異質性的疾病，與多基因、多因素相關聯。目前已有報道顯示MTNR1B基因多態性涉及生殖的各個環節［2-4］，并且有研究［5］顯示其SNP多態性與PCOS有密切相關性。但其相關研究尚處于個案報道的探索階段。為此，我們來探討MTNR1B基因的單核苷酸多態性與PCOS發病的關系，及與PCOS的臨床特征、內分泌水平、血糖水平的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2012年1月～2013年5月在青島市婦女兒童醫院生殖中心就診的PCOS患者182例為實驗組，平均年齡（32.28±3.43）歲。PCOS診斷標準參照2003年鹿特丹標準。選擇同期196例非PCOS不孕患者作為對照組，主要因輸卵管因素、男方因素在我院進行輔助生育技術治療。所有研究對象均為中國漢族人，均排除全身性疾病、泌尿生殖系統感染性疾病和家族遺傳性疾病。

1.2實驗方法

（1）抽血時間為月經周期的第3～5天或月經不規律者在B超檢查未見優勢卵泡時，閉經者日期不限，禁食12 h，于清晨抽取靜脈血5 mL，取2 mL采用化學發光酶免疫技術分別檢測血清卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）、血清泌乳素（PRL）和睪酮（T），并計算LH/FSH值，同時PCOS組患者測定空腹血糖。所有研究對象均測量身高（cm）、體重（kg），并計算體重指數（Body mass index，BMI），BMI=體重（kg）/身高（m）2。

（2）取200 μL血樣（EDTA抗凝）加入到1.5 mL離心管中，加入20 μL Proteinase K溶液，200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃水浴，加入200 μL無水乙醇，12 000 rpm離心30 sec，去除上清，再加500 μL緩沖液GD，12 000 rpm離心30 sec，棄廢液，加入600 μL緩沖液PW，12 000 rpm離心30 sec，棄廢液，重復1次，12 000 rpm離心2 min，倒掉廢液。最后滴加100 μL洗脫緩沖液TB，室溫放置2～5 min，12 000 rpm離心2 min，將收集到到的DNA放置-20 ℃冰箱保存備用。

（3）PCR擴增的目的基因，測序引物合成：MTNRlB基因的rsl0830963的測序引物參照文獻設計，上游引物5ˊ-TTCTGGGGTACGTTGATGATTG-3ˊ，下游引物：5ˊ-AACAGGGG CCACAGTGCA-3ˊ。20 μL測序PCR反應體系為dH2O 8 μL ，10-30 ng/μL DNA 1 μL，20 μmol/L上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCRMasterMix 10 μL。PCR反應條件：預變性95℃，5 min；變性95℃，30 sec；退火60℃，30 sec；延伸72℃，30 sec；共35個循環；終止72 ℃，7 min。PCR產物可于4℃保存。PCR反應結束后，取2 μL擴增產物加入含有溴化乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，經紫外線投射下檢測，顯示擴增產物片段長度為296 bp（圖1），上海桑尼公司純化、基因測序。

圖1　PCR產物0.8%瓊脂糖電泳圖

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，計數資料采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結 果

2.1兩組一般臨床資料、生化指標間的比較

PCOS組的年齡、身高、不孕年限及RPL與對照組相比無明顯差異；PCOS組體重明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），=。BMI、LH、E、LH/FSH和睪酮水平也明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。FSH水平低于對照組。見表1。

表1　PCOS組與對照組臨床特征及內分泌激素水平比較

2.2MTNR1B SNP rsl0830963位點在對照組及PCOS組基因型頻率和等位基因頻率比較

兩組受試者各基因型的頻率按Hardy-weinberg遺傳定律進行群體平衡檢驗，均符合遺傳平衡定律（P＞0.05）。MTNR1B基因 rsl0830963位點有三種基因型，分別為CC、GC、GG（見圖2、3、4）。在182例PCOS患者中，GG的基因型頻率為23.63%（43/182），GC的基因型頻率為48.90%（89/182），均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、3。在PCOS中G等位基因的基因頻率為48.08%（175/364），高于對照組的39.29%（154/392），差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2　SNP位點rs10830963 在PCOS組和對照組中的基因型頻率比較

表3　MTNR1B基因rs10830963位點在兩組中等位基因頻率比較

圖3　GC基因型

圖4　CC基因型

2.3PCOS組及對照組各基因型與臨床特征及生化指標的關系

在rs10830963位點中，PCOS組GG/GC基因型與CC基因型相比，其中空腹血糖有顯著性差異（P＜0.05），體重、BMI及激素水平無明顯差異（P＞0.05），見表4。在對照組中，體重、BMI、內分泌激素水平在不同基因型間比較均沒有明顯差異（P＞0.05）。見表5。

表4　PCOS組中不同基因型間各臨床特征及生化指標的比較

表5　對照組中不同基因型間各臨床特征及生化指標的比較

3　討 論

褪黑素（MLT）是一種神經內分泌激素，屬于吲哚類，主要由腦部松果腺合成和分泌，呈現晝高夜低的節律水平。它不僅可保持生物內環境協調的同步化，調節生物晝夜節律，對抗氧化、抗腫瘤活性，性成熟及生殖免疫反應等也具有重要作用［6］。MLT分泌的節律性與許多生物學功能密切相關，尤其是新陳代謝。Woo MM［7］認為褪黑激素起著直接調節卵巢功能的作用。褪黑激素能通過與顆粒黃體細胞中的褪黑素受體結合，調節孕激素的分泌，LH受體、促性腺激素釋放激素受體的基因表達，發生機制可能是褪黑激素通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號傳導通路介導，激活核內的轉錄因子Elk-1，使其磷酸化，從而參與細胞增殖與分化的調控。

人體內MLT的效應是由MTNR1A和MTNR1B兩種不同受體介導［8］，均為7跨膜G蛋白偶聯受體超家族成員，存在PKC、PKA磷酸化位點等，可通過激活cAMP信號或磷脂酰肌醇信號通路等介導細胞不同功能。褪黑素膜受體廣泛存在于下丘腦、垂體、生殖系統的卵巢、子宮、輸卵管及睪丸中，其中卵巢受體特異性結合量最高。進入核內的褪黑素與受體形成復合物，調控靶細胞的基因轉錄，影響基因的表達。

MTNR1B作為褪黑激素信號傳導通路的關鍵環節，基因的多態性可能會引起受體表達與功能的改變，從而影響褪黑素信號傳導，導致多種疾病的發生。2009年Prokopenko等［9］進行了多項全基因組關聯研究，發現MTNR1B的rs10830963變異與空腹血糖水平關聯最強，此位點處G突變因子可以使空腹血糖增加，且與β細胞的功能損害有密切聯系。國內外均有研究顯示：MTNR1B rs10830963和其他基因位點具有協同效應，可以升高血糖異常，損害β細胞功能，降低胰島素分泌，進而增加患2型糖尿病的風險［10-11］。在本研究中，在SNP rsl0830963位點，不同基因型PCOS婦女的空腹血糖水平比較有差異，差異有統計學意義（P＜0.05），BMI、體重、及激素水平無明顯差異（P＞0.05）。說明SNP rsl0830963位點與PCOS的血糖水平有一定關系，可能是G突變因子使空腹血糖增加，與目前的研究結果相一致。

褪黑激素在生殖過程中起著重要作用。活性氧在生理水平時可以促進細胞增殖、分化，在高水平時不僅可以使細胞凋亡或受損，導致細胞代謝、功能和結構改變，甚至導致DNA損傷。卵泡液中的活性氧失衡可以導致卵母細胞受損、卵泡閉鎖、卵泡成熟障礙等。褪黑激素及其代謝產物是一種強大的抗氧化劑和直接自由基清除劑，可以很好的保持動態平衡，減少線粒體氧化應激反應，可以保護生殖細胞免受損傷，促進卵泡發育、成熟。而且研究［12］發現卵巢具有褪黑素旁分泌功能，卵泡液中褪黑素水平比血清中高3倍，且與晝夜及季節性節律無關，對卵泡發育及成熟極其重要。崔媛媛的研究中示PCOS組血清褪黑素水平比正常組升高，而卵泡膜中褪黑素水平卻較低，說明褪黑素與PCOS病理生理學改變有著密不可分的聯系。褪黑素不僅與人類的生殖過程息息相關，在動物中也如此。有研究示，對大鼠進行持續光照或摘除松果體，可出現類似于PCOS的癥狀及病理改變，如動情周期延長，卵巢表面上皮及間質增生、呈多囊樣改變，持續無排卵等［13］。PCOS為排卵障礙性疾病，可推測褪黑素受體基因多態性與PCOS發病有關。除此之外，PCOS的患者多伴有肥胖、胰島素抵抗，與2型糖尿病的臨床特征及病理生理學機制及其相似，而MTNR1B的基因多態性已被發現可以增加糖尿病發生的危險性，由此推斷MTNR1B的多態性也是PCOS的一個發病原因。本研究的結果驗證了MTNR1B基因多態性與PCOS的發生確實有密切聯系，rs10830963基因多態性可能影響到了褪黑素受體表達或功能變化，使褪黑激素發生了異常，從而導致PCOS的發生。在實驗中，PCOS組中GG和GC基因型頻率（23.63%、48.90%）均高于正常組，而且PCOS組等位基因G的頻率也明顯高于對照組，差異具有顯著性。在兩組中，無論是基因型還是等位基因頻率，均具有顯著性差異，表明MTNRlB基因是中國漢族婦女PCOS的易感基因。李超［5］等人的研究示SNP rsl0830963位點是中國漢族人群PCOS的易感位點，與PCOS的發生發展以及病理生理改變有相關性，而且該多態位點與PCOS的胰島素抵抗、血糖升高密切相關。本研究的結果與李超等人的結果相一致，都表明MTNRlB基因的單核苷多態性與PCOS的發病有一定的關系，至于具體的發病機制目前只是一個初步的探討，還需進一步的研究來闡述。

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本文編輯：蘇日力嘎

【中圖分類號】R71

【文獻標識碼】A

【文章編號】ISSN.2095-8803.2016.05.145.04

作者簡介：楊金芳（1978-），女，山東濱州人，碩士，主治醫師，研究方向：生殖內分泌

通訊作者：楊金芳，Tel：18293190817，E-mail：sd3498@163.com

Association of rs10830963 SNPs in the melation receptor （MTNR IB）gene with polycystic ovary syndrome

YANG Jin-fang1*, YANG Hai-mei1, CHENG Zhi-juan2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology, Binzhou People's Hospital, Shandong Binzhou 256600,China；2.Department of Obstetrics and Gynecology, Yangxin County People s Hospital,Shandong Binzhou 256600,China）

【Abstract】Objective The current study was aimed to evaluate the association between MTNR1B gene polymorphisms and polycystic ovary syndrome. In addition, the relationship of clinical features, endocrine level and glucose levels with PCOS patients would be discussed. Methods The single-nucleotide polymorphisms （SNPS）, rsl0830963, in the MTNRlB gene were detected in 182 PCOS patients and 196 patients under-going IVF who were due to male factor or tubal factor. The single nucleotide polymorphisms （SNPs） were detected through polymerase chain reaction and a direct sequencing protocol. Serum hormone levels and plasma glucose level were detected. Results （1） The difference of CC, GC and GG three-genotype distribution between the two groups had statistical signifi cance （P＜0.05）. G allele frequency in PCOS group （48.08%） was signifi cantly higher than that in the controls （39.28%）, and it had statistical signifi cance （P＜0.05）. （2） The SNP, rs10830963 was signifi cantly associated with higher plasma glucose concentrations （P＜0.05）.There was no significant difference in the clinical and hormone levels in PCOS women with different genotypes in the SNP.Conclusion MTNR1B gene polymorphism is associated with the pathogenesis of PCOS. The SNP, rsl0830963, in the MTNRlB gene is not only associated with susceptibility to PCOS, but also with the level of fasting plasma glucose of PCOS patients.

【Key words】Melation receptor; Nucleotide polymorphisms; Polycystic ovary syndrome