氣質聯用法和MALDI-TOF-MS測定羥丙基-β-環糊精平均取代度

張　璟，高保衛，蔡崇林，唐光輝，王智輝，吳興元

(1.西北農林科技大學 無公害農藥研究服務中心/ 陜西省生物農藥工程技術研究中心，陜西楊凌　712100；2.西北農林科技大學 林學院，陜西楊凌　712100)

氣質聯用法和MALDI-TOF-MS測定羥丙基-β-環糊精平均取代度

張璟1，高保衛1，蔡崇林1，唐光輝2，王智輝1，吳興元1

(1.西北農林科技大學 無公害農藥研究服務中心/ 陜西省生物農藥工程技術研究中心，陜西楊凌712100；2.西北農林科技大學 林學院，陜西楊凌712100)

摘要為建立氣質聯用(GC-MS)和基質輔助激光電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)測定羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)平均取代度的方法。對HP-β-CD先進行甲基化反應，后將其酸水解為單環葡萄糖單元，通過硼氫化鈉還原成鏈狀葡萄糖單元，經羥基乙酰化后，進行氣質聯用分析，計算平均取代度(DS)，并與MALDI-TOF-MS測定的結果進行比較。結果表明：利用GC-MS分析測得的DS為7.0，略高于使用MALDI-TOF-MS測得結果(DS=6.6)。GC-MS分析方法靈敏度較高，但是前處理步驟較為繁雜，MALDI-TOF-MS法能夠快速檢測樣品，2種方法均可提供相關分析方法依據。

關鍵詞羥丙基-β-環糊精；平均取代度；氣質聯用；MALDI-TOF-MS

羥丙基-β-環糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin, HP-β-CD)是β-環糊精(β-CD) 與1, 2-環氧丙烷縮合而成的親水性衍生物(圖1)。該分子不具有還原性，在堿性介質中很穩定，能被強酸分解，與β-CD一樣具有分子包合作用，對人體無毒。與β-CD不同的是，HP-β-CD在常溫下水溶性高，在生物體內可促使包含物質迅速釋放，表面活性、溶血活性低，使用更安全，是目前研究及應用最為廣泛的β-CD衍生物。β-CD 的R2、R3和R6上的羥基被羥丙基隨機取代,生成2-HP-β-CD、2, 3-DiHP-β-CD、2, 6-DiHP-β-CD 及2, 3, 6-TriHP-β-CD 等同系物。取代基數目對HP-β-CD物系的物性有重要影響，如溶血性、吸濕性和增溶能力均隨取代度的增大而降低[1-6]。

關于HP-β-CD平均取代度的測定方法，目前尚無可靠和統一的規范。Schneide等[7]采用核磁共振氫譜和碳譜對 α-環糊精、β-環糊精及γ -環糊精進行分析研究；宋元德等[8]建立測定無對照品或者指示劑的HP-β-CD平均取代度的核磁共振氫譜方法；Pitha等[9]和Pitha[10]對HP-β-CD利用不同方法測定平均取代度(DS)，用核磁法測得DS=7，而質譜法測得DS=8.02；郝愛友等[11]報道化學滴定方法測定HP-β-CD取代度，無需大型儀器，在一般實驗室即可實現平均取代度的測定；張毅民等[12]用紫外光譜法測定HP-β-CD平均取代度；張敏等[13]利用基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)檢測β-CD與環氧丙烷的反應，合成出低取代(取代度< 8)的HP-β-CD。

目前，國內尚無氣質聯用法測定 HP-β-CD 平均取代度的相關報道，本研究采用氣質聯用(GC-MS)和MALDI-TOF-MS分析法測定HP-β-CD的平均取代度，為相關研究提供一定的方法借鑒。

1材料與方法

1.1試劑和儀器

HP-β-CD(西安德立生物化工有限公司)；二甲亞砜，氫氧化鈉，碘甲烷，氯仿，三氟乙酸，氨水，硼氫化鈉，乙酸，甲醇，吡啶，乙酸酐，氯仿，無水硫酸鈉等均為化學純；POLARIS QGC-MS氣質聯用儀(美國Thermo fisher公司)；AXIMA-CFR plus MALDI-TOF MS基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜儀(日本島津公司)。

圖1　羥丙基-β-環糊精的結構

1.2HP-β-CD前處理方法

1.2.1HP-β-CD的甲基化參照文獻[9]的方法。稱取100 mg HP-β-CD放入圓底燒瓶中，加入20 mL干燥的二甲亞砜，0.5 g氫氧化鈉粉末，5 mL碘甲烷，用橡皮塞封緊瓶口，在室溫下攪拌反應過夜。然后加入25 mL水，搖勻，再用20 mL×5氯仿提取，合并有機相，用20 mL水洗滌2次，減壓蒸餾除去溶劑，得淡黃色甲基化產物。

1.2.2甲基化HP-β-CD的水解與還原向HP-β-CD甲基化產物里加入15 mL(2 mol/L)的三氟乙酸，在120 ℃下攪拌回流1 h，然后在50 ℃下用旋轉薄膜蒸發儀蒸干溶劑，再加入10 mL(2 mol/L)的氨水，搖勻以便中和殘存的痕量三氟乙酸。然后加入0.5 g硼氫化鈉和15 mL(2 mol/L)的氨水配成的溶液，在60 ℃下反應60 min，降至室溫，加入10 mL乙酸，使混合物通過陽離子交換樹脂以除去其中的NH4+和Na+，通過離子交換樹脂的混合物在60 ℃下旋蒸至干，得到的殘余物用適量干燥甲醇溶解，再在60 ℃下旋蒸至干，如此反復3次以除去殘余的硼，得到的油狀物為水解還原后的鏈狀D-葡萄糖衍生物。

1.2.3乙酰化參照文獻[14-15]的方法。將上述反應產物用20 mL吡啶溶解，在0 ℃下加入新蒸的10 mL乙酸酐，加完后用橡皮塞封口，室溫攪拌反應過夜。反應完畢后在50 ℃下除去溶劑，殘余物用60 mL氯仿溶解，用10 mL飽和食鹽水洗滌3次，用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸干溶劑，得淡黃色油狀物，待測。

1.3GC-MS分析條件

非極性毛細管柱TR-1MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：始溫160 ℃，以3 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min，載氣為氦氣；離子源溫度：200 ℃；進樣口溫度：250 ℃；分流比：20∶1；溶劑延遲時間：3 min；EI源：離子化電勢70 eV。

1.4MALDI-TOF MS分析條件

采用氮激光儀，激發波長337 nm，激光脈沖寬度為3 nm，信號為激光器單次掃描50次累計結果。以α-氰苯-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)為基體，將基體與樣品按1 000∶1 摩爾比混合均勻，取1 μL滴于樣品臺上室溫干燥，送入離子源中。

1.5平均取代度的計算

GC-MS通過分子離子峰的峰高和質量來計算HP-β-CD的DS，具體公式為：

(1)

式中，Hi和Mi分別為每個分子離子峰的峰高和質量，1 135為β-CD分子量。

MALDT-TOF-MS的DS計算具體公式為：

(2)

2結果與分析

2.1色譜條件的優化

由于待測物組分比較復雜，通過毛細管色譜柱將單取代、多取代及混合取代等不同取代的β-CD完全分離具有一定難度，對于這些復雜成分，適當地調整程序升溫速度，可使分離結果得到改善，但同時會使保留時間延長，導致峰型變寬，靈敏度降低，分析時間過長會降低實際檢驗的工作效率。為達到理想分離結果，本研究通過調整程序升溫速度、更換不同極性色譜柱(TR-1MS，TR-5MS，HP-5MS)、改變載氣流速等方法，最終確定色譜分離條件為色譜柱TR-1MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；初始溫度160 ℃， 3 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。總離子流色譜圖見圖2。

2.2GC-MS分析

圖3為HP-β-CD經水解、還原和乙酰化后的產物，其中的R2、R3和R6分別為和C2、C3、C6通過醚鍵相連的羥丙基(羥丙基上的羥基在樣品處理的第1步被甲基化)或甲基(未被羥丙基取代的羥基在樣品處理的第1步被甲基化)。

因此，對上述HP-β-CD經水解、還原和乙酰化后的產物進行GC-MS分析，參考Pitha等[9]和Pitha[10]分析方法并在其基礎上進行一定的修改，對HP-β-CD分子上羥丙基的取代度以及羥丙基取代在β-CD的葡萄糖單元的C2、C3、C6上的分布情況進行分析。

經GC-MS分析表明(表1)，無取代的葡萄糖單元含量為24.4%，單取代的葡萄糖單元含量為53.4%，雙取代的葡萄糖單元含量為20.0%，三取代的葡萄糖單元含量為2.2%，取代位置以2位為主，6位次之，3位最少，同時還有部分2,3-和2,6-雙取代和少量的2,3,6-三取代，根據公式(1)計算得HP-β-CD的DS為7.00。

圖2　總離子流色譜圖

圖3　乙酰化D-葡萄糖醚

2.3MALDI-TOF MS基質選擇

為得到更準確的檢測結果，減少基質對檢測結果的影響，本研究分別用α-CHCA、芥子酸(SA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)這3種基質與HP-β-CD混溶進行MALDI-TOF MS檢測，經過對比試驗，發現α-CHCA檢測的效果最好，DHB次之。試驗結果表明：采用不同的基質對HP-β-CD的檢出結構有明顯影響，適當地換用不同基質進行分析，才能確定最佳分析條件。

2.4MALDI-TOF MS質譜分析

從圖4可見，離子1 329.59，1 387.51，1 446.05，1 503.77，1 562.10，1 620.45，1 678.53，1 736.40分別為β-CD(1 135)+23+3×58(羥丙基)，β-CD+23+4×58，β-CD+23+5×58，β-CD+23+6×58，β-CD+23+7×58，β-CD+23+8×58，β-CD+23+9×58，β-CD+23+10×58的離子，即β-環糊精與三取代、四取代、五取代、六取代、七取代、八取代、九取代、十取代羥丙基分別和鈉的加和離子，且基峰為含有7個羥丙基的β-環糊精與鈉的加合離子，根據公式(2)計算其HP-β-CD的DS為6.6。

表1　氣質聯用法測定HP-β-CD各取代成分比例

圖4　HP-β-CD的MALDI-TOF質譜圖

3結 論

GC-MS分析方法測定HP-β-CD平均取代度，需要進行樣品前處理。首先，通過酸水解將其分解為單環葡萄糖單元，然后通過硼氫化鈉還原成鏈狀葡萄糖單元，為防止在酸水解時未被羥丙基化的葡萄糖單元上的羥基和羥丙基上的羥基在酸水解過程發生脫羥基反應、以及在硼氫化鈉還原時被還原，在水解之前先用過量的碘甲烷將HP-β-CD上所有的羥基都保護起來，然后進行水解和還原。還原成鏈狀的單糖后，由于單糖分子上至少含有2個羥基，極性大，沸點高，無法用GC-MS準確分析，需要用過量乙酸酐將所有羥基乙酰化后才能進行分析。

利用GC-MS分析法測得的平均取代度略高于MALDI-TOF-MS方法所得結果，可能是由于GC-MS分析方法通過分子離子峰的峰高和質量計算HP-β-CD的平均取代度，而樣品中若含有雜質會導致分子離子峰的峰高和質量偏大，使得HP-β-CD的平均取代度值偏大。

GC-MS分析方法靈敏度較高，但是前處理步驟較為繁雜，MALDI-TOF-MS方法不需對樣品進行前處理，能夠快速分析，直接檢測樣品。2種方法各有優勢，均可為今后相關研究工作提供分析方法方面的參考依據。

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Received 2015-05-13Returned2015-07-07

First authorZHANG Jing , female, experimentalist, Ph.D student. Research area:synthesis and analysis of pesticide. E-mail: zhjing008@126.com

(責任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

Determination of Average Degree of Substitution of Hydroxypropyl-β-cyclodextrin by Gas Chromatography Mass Spectrometry and MALDI-TOF-MS

ZHANG Jing1, GAO Baowei1, CAI Chonglin1,TANG Guanghui2,WANG Zhihui1and WU Xingyuan1

(1.Shaanxi Research Center of Biopesticide Technology and Engineering , Biorational Pesticide R&D Center Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China;2.College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractGC-MS and matrix-assisted laser desprption-ionization time of flight mass spectro (MALDI-TOF-MS) metry were established to measure degree of substitution of hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin methylation reaction, then were decomposed into acid hydrolysis monocyclic glucose units by sodium borohydride reduction into chains of glucose units, after hydroxyl acetylation of GC-MS, we calculated the average degree of substitution. We compared it with those gained from the method of MALDI-TOF-MS.The average degree of substitution was 7.0 which was examined by GC-MS,slightly higher than MALDI-TOF-MS with measured results (DS=6.6).GC-MS analysis had high sensitivity, but the pre-treatment step was more complicated. MALDI-TOF-MS detected the sample rapidly, both methods were available to measure the degree of substitution of hydroxypropyl-β-cyclodextrin which can provide a basis for correlation analysis.

Key wordsHydroxypropyl-β-cyclodextrin; Degree of substitution; GC-MS; MALDI-TOF-MS

收稿日期：2015-05-13修回日期：2015-07-07

基金項目：西北農林科技大學大型儀器設備新功能開發項目(dysb130307)。

通信作者：高保衛，男，實驗師，主要從事農藥合成和分析的研究。E-mail:gaobaowei72@163.com

中圖分類號S482.92；O657.6

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)06-0945-05

Foundation itemKey Scientific Instrument and Equipment Development Project of Northwest A&F University(No. dysb130307). GAO Baowei, male, experimentalist. Research area: synthesis and analysis of pesticide .E-mail: gaobaowei72@163.com

網絡出版日期：2016-06-01

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0920.044.html

第一作者：張璟，女，實驗師，在讀博士，從事農藥合成和分析的研究。E-mail:zhjing008@126.com