抗重金屬銅離子單克隆抗體的制備及其免疫學特性

孫　勇,付世杰,秦保亮,王亞楠,姜金慶,王自良

(河南科技學院 動物科學學院, 河南新鄉453003)

抗重金屬銅離子單克隆抗體的制備及其免疫學特性

孫勇,付世杰,秦保亮,王亞楠,姜金慶,王自良

(河南科技學院 動物科學學院, 河南新鄉453003)

摘要為制備抗Cu2+的高效價、敏感、特異的單克隆抗體，采用已合成的銅離子人工抗原Cu2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠，通過間接ELISA和阻斷ELISA篩選備用小鼠，用細胞融合技術制備抗Cu2+的單克隆抗體。結果篩選到4株特異性強、靈敏度高的雜交瘤細胞，其中雜交瘤細胞株2B8培養上清中的抗體效價采用間接ELISA檢測為1∶(1.28×103)，用其制備的腹水中抗體效價為1∶(5.12×105)，該單克隆抗體為IgG1/κ型，對Cu2+-EDTA的半數抑制質量濃度(IC50)為29.78 μg/L，與Zn2+-EDTA的交叉反應率(CR)為26.0%，與其他金屬螯合物沒有交叉反應，表明獲得特異性較好的抗Cu2+的單克隆抗體，可用于銅離子的免疫學檢測。

關鍵詞銅離子；單克隆抗體；免疫學特性

重金屬銅通常以二價離子形式(Cu2+)存在，通過食物鏈的富集對人和動物產生危害，過量的銅會令動物出現惡心、嘔吐、上腹疼痛、急性溶血和腎小管變形等中毒現象，嚴重者還可導致急性腎衰竭等[1]。由于硫酸銅能促進蛋氨酸吸收，對仔豬生長有促進作用，因此飼料中往往添加高銅添加劑，采食高銅飼料的豬糞便中所殘留的銅排入環境會對土壤水源造成污染，因此，對于銅離子的檢測尤為重要[2]。

檢測銅離子的傳統方法多為物理化學儀器檢測法，如原子吸收光譜分析法(AAS)、電感耦合等離子發射光譜法(ICP-AES)、原子熒光法(AFS)、陽極溶出伏安法(ASV)和X射線熒光光譜法(XRF)等[3]，這些檢測方法雖然靈敏度高、精確性好，但所需儀器價格昂貴，并且需要專業培訓，往往僅限于實驗室人員操作而不適合大范圍普及。為滿足靈敏度高、特異性強而且簡單快速的檢測需求，免疫分析測定技術就成為人們檢測重金屬離子的一種重要方法。本研究旨在制備高效價、敏感、特異的抗Cu2+-EDTA 單克隆抗體，為免疫檢測方法的建立奠定基礎。

1材料與方法

1.1試 劑

CuSO4·5H2O，Alfa Aesar產品，純度98.0%～102.0%；異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)，上海同仁化學研究所；BSA和OVA，單克隆抗體同種型鑒定試劑盒，Pierce產品；ELISA所用洗液(PBST)為0.01 mol/L、pH 7.4φ(Tween-20)=0.05%的磷酸鹽緩沖液(PBS)；包被液為0.1 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)；封閉液、稀釋液為φ(豬血清)=5%的PBST；酶底物為含TMB的磷酸檸檬酸緩沖液；終止液為2 mol/L的硫酸溶液；試驗用水為重蒸去離子水。其他試劑均為AR級。

RPMI-1640細胞培養基，HAT、HT培養基，均為Gibco產品；二甲基亞砜(DMSO)，臺盼藍，均為Sigma公司產品；PEG-1500，Roche公司產品；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司產品；酚紅，北京索萊寶科技有限公司產品。

免疫抗原Cu2+-ITCBE-BSA和包被抗原Cu2+-ITCBE-OVA由河南科技學院殘留物檢測實驗室制備。

1.2儀 器

LDZX-30KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；TS100型倒置生物顯微鏡，Nikon公司；Galaxy S型CO2細胞培養箱，Biotech公司；725型Thermo Forma超低溫冰箱，Multiskan MK3酶標儀，Thermo公司。

1.3動物與細胞

Balb/C小鼠購自鄭州大學醫學院；小鼠骨髓瘤細胞株NS0由河南省動物免疫學重點實驗室惠贈，河南科技學院動物科學學院動物疫病與殘留防控中心實驗室凍存。

1.4試驗方法

1.4.1 Cu2+-EDTA mAb雜交瘤細胞株的建立細胞融合備用小鼠的免疫與選擇：采用背部皮下4點注射法，用Cu2+-ITCBE-BSA免疫6周齡的雌性Balb/C小鼠，根據免疫蛋白的質量濃度，分為低劑量組每只20 μg(0.2 mL)、中劑量組每只60 μg(0.2 mL)和高劑量組每只 100 μg(0.2 mL)，每組5只小鼠。首免間隔4周進行第2次免疫，共免5次，最后1次免疫后第10天斷尾采血，間接ELISA檢測血清抗體效價，阻斷ELISA檢測其抑制效價。根據耳標號選擇抗體效價高、抑制效價好的小鼠脾細胞進行融合。

細胞融合與陽性雜交瘤細胞株的篩選：細胞融合參見文獻[4]進行，用間接ELISA和阻斷ELISA進行陽性雜交瘤細胞株的篩選。選擇強陽性、抑制效果好、細胞生長旺盛的孔，用有限稀釋法亞克隆后擴大培養、凍存并鑒定。

雜交瘤細胞核型鑒定：雜交瘤細胞核型鑒定采用秋水仙素阻斷法[5]，取對數生長期的雜交瘤細胞株傳代培養48 h，用終質量濃度為0.05～0.1 mg/L 的秋水仙素處理4～6 h，收集細胞后用低滲KCl處理30 min，固定液固定，滴加細胞懸液到4 ℃預冷的載玻片上，室溫自然干燥，用φ=10% 的Giemsa染色，去離子水洗脫，光學顯微鏡下觀察，計數。每株計數5個細胞，記錄染色體數目并計算平均值。

雜交瘤細胞穩定性檢測：分別將凍存15、30和60 d的雜交瘤細胞復蘇，培養后取上清液，間接ELISA和阻斷ELISA測定抗體效價與敏感度，考察雜交瘤細胞分泌單克隆抗體的穩定性[6]。

1.4.2Cu2+-EDTA mAb的制備及免疫學特性鑒定Cu2+-EDTA mAb的制備：采用體外培養法[7]和體內誘生腹水法[8]獲得抗體，用飽和硫酸銨鹽析法[9]純化后測定IgG的效價、敏感性、特異性。

同種型鑒定：按試劑盒說明操作。

效價測定：用間接ELISA測定效價。

敏感性鑒定：用阻斷ELISA測定Cu2+-EDTA mAb對不同質量濃度Cu2+-EDTA的抑制率，以抑制率B/B0為縱坐標，以Cu2+-EDTA質量濃度的常用對數為橫坐標，繪制標準抑制曲線，計算Cu2+-EDTA mAb對Cu2+-EDTA的IC50。

特異性鑒定：采用交叉反應試驗，選擇鋅、鉻、鉛、鎘、鈷、鉬、鈣等金屬離子與EDTA的螯合物為抑制劑，用阻斷ELISA測定Cu2+-EDTA mAb對各抑制物的IC50，以Cu2+-EDTA mAb對Cu2+-EDTA的IC50和Cu2+-EDTA mAb對各抑制劑的IC50之比的百分數為其交叉反應率(CR)。

2結果與分析

2.1細胞融合備用小鼠的血清效價和血清敏感性測定結果

由圖1可知，免疫小鼠血清抗體效價均達到1∶104，說明獲得較好的免疫效果，其中3號小鼠血清抑制效果最好，3號小鼠血清的抑制曲線回歸方程為y=-37.08x+106.71，R2為0.963 5，IC50為33.8 ng/mL。

圖1　3號小鼠多抗血清對Cu2+-EDTA

2.2Cu2+-EDTA mAb雜交瘤細胞株的建立

雜交瘤細胞株的篩選：細胞融合10 d后觀察融合效果，4塊細胞培養板384孔中，有雜交瘤細胞克隆形成的有352孔，融合率為91.7%；采用間接ELISA和阻斷ELISA檢測，陽性52孔，陽性率為14.8%；3次亞克隆后篩選出4株雜交瘤細胞，分別命名為1F7、2B8、3G5、3D10。

雜交瘤細胞核型鑒定結果：小鼠脾細胞染色體數目為40，NS0染色體數目為62～68，獲得的4株雜交瘤染色體數目平均分別為97.2、98.5、98.8和101，平均為98.8。

單克隆抗體同種型鑒定結果：用mAb同種型試劑盒鑒定，1F7、2B8、3G5、3D10同種型分別為IgG1/κ、IgG1/κ、IgG1/λ、IgG2a/κ。

雜交瘤細胞的穩定性測定結果：4株雜交瘤細胞凍存前細胞培養上清效價與凍存15、30和60 d復蘇培養后上清效價基本一致，說明4株雜交瘤細胞分泌抗體的穩定性良好。

2.3Cu2+-EDTA mAb的免疫學特性鑒定

2.3.1效價測定由表1可知，雜交瘤細胞分泌的Cu2+-EDTA mAb具有較高的效價，2B8株的最高，其細胞培養液上清和腹水中抗體效價分別達到1∶(1.28×103)和1∶(5.12×105)。

表1　Cu2+-EDTA mAb的抗體效價檢測結果

2.3.2敏感性測定由表2可知，4株單抗均有較好的敏感性。由圖2可知，2B8株的敏感性最好，曲線回歸方程為y=-36.916x+104.43，IC50為29.78 μg/L。

表2　Cu2+-EDTA mAb阻斷ELISA抑制曲線的

2.3.3特異性鑒定由表3可知，2B8株mAb對Cu2+-EDTA的IC50為29.78 μg/L，對Zn2+-EDTA的IC50為114.56 μg/L，交叉反應率為26.0%，與EDTA及其他金屬離子螯合物無交叉反應。

圖2　Cu2+-EDTA mAb對Cu2+-EDTA

化合物CompoundIC50/(μg/L)交叉反應率/%Cross-reactivityCu2+-EDTA29.78100EDTA>6.40×103<0.5Zn2+-EDTA114.5626.0Cr2+-EDTA>3.20×103<0.9Pb2+-EDTA>6.40×103<0.5Cd2+-EDTA>3.20×103<0.9Co2+-EDTA>3.20×103<0.9Mo2+-EDTA>6.40×103<0.5Ca2+-EDTA>6.40×103<0.5

3討 論

3.1細胞融合備用小鼠的選擇

對于抗銅離子的人工抗原，不同的免疫劑量對小鼠的免疫效果有不同的影響，劑量過小無法刺激機體產生免疫反應，劑量過大會引起小鼠的應激反應，甚至產生腫瘤。本試驗分別選擇低劑量每只20 μg、中劑量每只60 μg、高劑量每只100 μg免疫小鼠，結果表明，低劑量免疫組的免疫效果最好，而高劑量免疫組中，5只小鼠有2只出現腫瘤。李俊鎖等[10]和Cooper等[11]的研究也表明，小劑量、長間隔是免疫首選方案。本試驗選擇每只20 μg的免疫劑量、4周的免疫間隔，得到很好的免疫效果。

3.2雜交瘤細胞株的篩選

可靠的雜交瘤細胞篩選體系一般有3個要求，一是能準確測定上清效價，二是避免橋抗體的影響，三是能確定mAb的敏感性[12]。本試驗采用間接ELISA和阻斷ELISA同時篩選陽性雜交瘤細胞，以Cu2+-ITCBE-OVA作為包被原，間接ELISA測定上清效價，以Cu2+-EDTA為標準品，采用阻斷ELISA確定陽性雜交瘤，可以簡便地篩選出效價高、無橋抗體、敏感性強的目的雜交瘤細胞株。

3.3交叉反應

Love等[13]認為，螯合劑通過化學鍵與金屬離子螯合，不同的金屬離子使螯合劑構型發生不同的改變，這是決定抗原抗體識別的重要因素。Jones等[14]采用距離矩陣法發現Cd2+-EDTA與Hg2+-EDTA的三維結構差異最小，認為這是產生交叉反應的主要原因。郭常偉等[15]制備的抗Cu2+單克隆抗體，也與Zn2+出現較強的交叉反應。本試驗中Cu2+-EDTA mAb與Zn2+-EDTA交叉反應率為26.0%，可能是因為銅與鋅分子質量接近，離子半徑接近，價態一樣所致。

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Received 2016-01-15Returned2016-03-07

First authorSUN Yong, male, master student. Research area: the food safety of animal biotechnology.E-mail:412061790@qq.com

(責任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Preparation and Immunology Character of Monoclonal Antibody of Heavy Metal Ion Copper

SUN Yong, FU Shijie, QIN Baoliang, WANG Yanan,JIANG Jinqing and WANG Ziliang

(College of Animal Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang Henan453003, China)

AbstractTo produce efficient, sensitive and specific monoclonal antibody, the experimental mouse was selected from the composited Cu2+-ITCBE-BSA to immunize Balb/C mouse by the means of indirect ELISA and blocking ELISA, and monoclonal antibody was prepared by cell fusion technology. The results showed that four hybridoma cell lines characterized as powerful specificity and high sensitivity were obtained. The indirect ELISA titers of 2B8 were 1∶(1.28×103) in supernatant and 1∶(5.12×105) in ascites. The isotype of the 2B8 mAb was IgG1/κ. The Cu2+-EDTA-mAb showed that the IC50of mAb to Cu2+-EDTA was 29.78 μg/L, 26.0% cross-reactivity to Zn2+-EDTA and little or no cross-reactivity with other compounds. The prepared monoclonal antibody of Cu2+-EDTA can be used for immunoassay of Cu2+.

Key wordsCopper ion；Monoclonal antibody；Immunological properties

收稿日期：2016-01-15修回日期：2016-03-07

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAK10B01)。

通信作者：王自良,男,教授,研究方向為動物性食品安全生物技術。E-mail:wangziliang1966@163.com

中圖分類號TS2071.3;S859.84

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)06-0836-05

Foundation itemThe “12th Five-year Plan” National Science and Technology Support Program(No.2011BAK10B01). WANG Ziliang, male, professor. Research area: the food safety of animal biotechnology. E-mail:wangziliang1966@163.com

網絡出版日期：2016-06-01

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0914.014.html

第一作者：孫勇,男,碩士研究生,研究方向為動物性食品安全生物技術。E-mail:412061790@qq.com