奶牛生乳中洛菲不動桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

林　杰，王旭榮，王　磊，王海瑞，朱永剛，楊志強，李建喜，張景艷

(中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州　730050)

奶牛生乳中洛菲不動桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

林杰，王旭榮，王磊，王海瑞，朱永剛，楊志強，李建喜，張景艷

(中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州730050)

摘要對29份外觀正常的奶牛生乳乳樣進行乳品質分析和細菌學檢測，利用16S rDNA序列分析鑒定乳樣中分離的菌株，并進行14種藥物的敏感性試驗。結果表明，10份乳樣有細菌檢出，其中4份乳樣中分離得到洛菲不動桿菌；藥物敏感性結果表明，洛菲不動桿菌對復方新諾明具有較強的耐藥性；乳品質分析結果表明，該4份乳樣體細胞數(SCC)偏高，乳成分和部分理化性質與其他正常乳無明顯區別。

關鍵詞洛菲不動桿菌；鑒定；耐藥性；乳品質

洛菲不動桿菌屬于不動桿菌屬，在自然界廣泛分布，是重要的機會致病菌，且致病性較強，其致病的報道[1]多見于人醫，如急性腸炎、呼吸道感染、敗血癥、腦膜炎、肺炎、肺膿腫、心內膜炎、生殖泌尿道感染、傷口及皮膚感染等。在人醫領域，院內不動桿菌感染已經得到一定重視，并有相關的跟蹤研究。在養殖業中，盡管已有洛菲不動桿菌引發畜禽感染的報道[2-3]，但并未引起相關人員的關注與重視。鑒于洛菲不動桿菌引起的感染一般較為嚴重，且容易獲得耐藥性，在養殖業中應該對洛菲不動桿菌給予一定關注。

該研究從西安某奶牛場的29份生乳乳樣中分離得到4株洛菲不動桿菌，考慮到其分離率偏高，對該4株菌進行藥物敏感性分析，并對該4份乳樣的乳品質及部分理化性質與其他25份乳樣進行分析比較。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1樣品采集2015年4月于西安某奶牛場選擇健康奶牛29頭，乳房外觀正常，棄去頭3把奶后，乳頭用碘伏和φ=75%酒精消毒，觀察乳汁外觀正常后，無菌收集4個乳區的混合乳樣，密封并做好標記，于冷藏箱中帶回實驗室。

1.1.2主要試劑營養肉湯、血瓊脂平板購自廣東環凱微生物科技有限公司；革蘭氏染液購自南京建成科技有限公司；Bacterial DNA Kit購自OMEGA BIO-TEK公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3主要儀器體細胞分析儀(FossomaticTMMinor )，乳成分分析儀(MikoScanTMFT 120)。

1.1.4藥敏紙片種類及抗生素劑量美洛西林(75 μg)、哌拉西林(100 μg)、替卡西林(75 μg)、頭孢吡肟(30 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、頭孢曲松(30 μg)、亞胺培南(10 μg)、美羅培南(10 μg)、慶大霉素(10 μg)、阿米卡星(30 μg)、四環素(30 μg)、復方新諾明(1.25/23.75)、環丙沙星(5 μg)、左氧氟沙星(5 μg)均購自OXOID。

1.2方 法

1.2.1細菌分離與純化將待檢乳樣搖勻，無菌操作，吸取10 μL乳汁均勻涂布于血瓊脂平板上，分別在有氧、37 ℃恒溫培養18～24 h，觀察細菌生長情況。對培養18～24 h無細菌生長的血瓊脂平板延長至48 h。挑取細菌單菌落進行涂片固定，革蘭氏染色，鏡檢。根據染色結果，挑取典型單菌落純化培養，細菌純凈后保存，備用。

1.2.216S rDNA序列分析將細菌接種于營養肉湯中，37 ℃培養24 h。按照試劑盒操作說明提取被檢細菌的DNA，并以此DNA為模板，用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit中的Forward Primer 和Reverse Primer 擴增16S rDNA片段。擴增片段送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，通過NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)在線BLAST軟件對獲取的序列進行搜索比對，并確定細菌種屬。

1.2.3乳成分與理化性質分析應用統計分析軟件 SAS V8分析比較含有洛菲不動桿菌的4份乳樣和其他25份乳樣中體細胞數、乳成分和部分理化性質的差異。

1.2.4藥物敏感性分析參考《CLSI的抗菌藥物敏感性試驗執行標準2013》，采用Kirby-Bauer(K-B)紙片擴散法測定分離菌株對抗菌藥物的敏感性。每株菌3個重復，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，取3個重復的平均值。參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI，2013)推薦的標準進行判定，按抑菌圈直徑大小將細菌對藥物的敏感性分為：耐藥(R)、中度敏感(I)和高度敏感(S)。

2結果與分析

2.1細菌分離結果

被檢乳樣29份中有10份檢出細菌，其中4份分離得到4株洛菲不動桿菌，在血平板上的菌落形態是：黃白色，表面光滑，圓形凸起，邊緣整齊，染色鏡檢結果為革蘭氏陰性球桿菌(圖1)。

圖1　革蘭氏染色鏡檢(×100)

2.216S rDNA序列分析結果

以提取的細菌DNA為模板，用16S rDNA細菌鑒定PCR試劑盒擴增16S rDNA片段，片段長度略大于500 bp(圖2)。序列比對結果表明，與洛菲不動桿菌(KR054982.1)相似度為99%，確定分離菌株為洛菲不動桿菌。

M. DL2000 DNA maker;L1～L4.菌株編號Strain number

圖2分離菌的16S rDNA PCR擴增

Fig.2Products of 16S rDNA of isolates

2.3乳成分與理化性質分析結果

29份乳樣體細胞數分布見圖3，體細胞數小于2×105mL-1的乳樣占樣本量的58.62%；小于3×105mL-1的乳樣占樣本量的65.52%。含有洛菲不動桿菌的乳樣中，1份體細胞數為2.62×105mL-1，其余3份乳樣體細胞數變幅為3×105～4×105mL-1。統計結果表明(表1)，分離出洛菲不動桿菌的乳樣的體細胞數明顯高于其他乳樣的平均水平；乳成分分析結果表明，總固形物、乳脂率偏低，但差異較??；理化性質分析結果差異不明顯。

圖3　體細胞數分布

2.4藥敏試驗結果

健康牛牛乳中分離得到的洛菲不動桿菌對抗生素的耐藥性較低，僅對復方新諾明具有較強耐藥性(圖4)。

表1　乳成分與理化性質統計±s)

S.敏感　Sensitive; I.中度敏感　Intermediate; R.耐藥　Resistant

3討論與結論

不動桿菌是非發酵糖類、專性需氧、氧化酶陰性、無鞭毛、無芽胞、不運動的革蘭氏陰性桿菌，其中鮑曼不動桿菌和洛菲不動桿菌是代表菌種，是重要的機會致病菌。洛菲不動桿菌不僅能引起多種院內感染，同樣能夠導致動物的不同感染。引起動物感染的報道涉及奶牛子宮內膜炎[2]、仔豬肺部感染、新生駒敗血癥[3]、馬流產[4]、兔急性感染[5]、大鼠的胃炎、高位泌素血癥[6]、蛙的傳染性抽搐癥[7]、鸚鵡的呼吸道感染[8]以及鴿子的關節炎[9]等，說明洛菲不動桿菌感染涉及大型家畜、嚙齒類、兩棲類以及禽類，其種屬分布范圍廣，且引起的感染均較嚴重。本試驗共29份乳樣，有4份乳樣分離得到洛菲不動桿菌，而奶牛乳房炎主要病原菌——大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌的分離率為0，表明乳樣中洛菲不動桿菌的分離率較高，且引起體細胞數的升高，故可以推測，該菌有引起奶牛乳房炎的風險，應給予一定的關注。

生乳是從符合國家有關要求的奶畜乳房中擠出的無任何成分改變的常乳。中華人民共和國發布的“GB19301-2010 食品安全國家標準”對生乳中體細胞數未作出明確限定，通過咨詢了解到，目前西北地區不同生乳收購站對生乳體細胞數要求不同，一般要求低于3×105mL-1或4×105mL-1，臨床認為體細胞數大于4×105mL-1或5×105mL-1時，多判定為患有隱性乳房炎。本試驗可以看出，若排除4份體細胞數大于4×105mL-1的乳樣后，含有洛菲不動桿菌的乳樣體細胞數明顯高于試驗中其他正常乳樣體細胞數的平均值。所以，洛菲不動桿菌引起生乳體細胞數增高會影響生乳的質量，甚至影響其銷售。

本次乳品質檢測過程中分離的洛菲不動桿菌耐藥性不高，對復方新諾明耐藥，與已有多數報道結果一致[10-11]。部分醫院內洛菲不動桿菌對青霉素、頭孢類以及復方新諾明的耐藥性基本達到50%以上，存在多重耐藥現象，且耐藥率上升較快，某醫院報道[12]其多重耐藥菌分離率經過2 a時間就從9.5%上升至23.2%。洛菲不動桿菌現已成為“超級耐藥菌的潛在菌群”[13-14]。由于部分奶牛場存在抗生素濫用問題，國內需要對牛場內的洛菲不動桿菌進行必要的監測，并對其藥物敏感性進行跟蹤。

參考文獻Reference：

[1]REGALADO N G,MARTIN G,ANTONY S J.Acinetobacterlwoffii:bacteremia associated with acute gastroenteritis[J].TravelMedicineandInfectiousDisease,2009,7(5):316-317.

[2]陳現偉.規?；瘓瞿膛Ｗ訉m內膜炎病原菌的分離鑒定[J].畜牧與獸醫,2008,40(2):72-74.

CHEN X W.Identification of pathogen from endometritis in scale farms [J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2008,40(2):72-74(in Chinese).

[3]ROBINO P,BERT E,TRAMUTA C,etal.Isolation ofAcinetobacterlwoffiifrom a lovebird (Agapornis roseicollis) with severe respiratory symptoms[J].SchweizerArchivFurtierHeilkunde,2005,147(6):267-269.

[4]朱娟娟,馮世文,廖黎黎,等.產房仔豬魯氏不動桿菌感染的診治[J].中國動物保健,2013,14(1):35-36.

ZHU J J,FENG SH W,LIAO L L,etal.diagnosis and treatment of piglet infected by brucellosis in delivery room[J].ChinaAnimalHeath,2013,14(1),35-36 (in Chinese).

[5]TURUTOGLU H,GULYAZ V,OZTURK M.Isolation ofAcinetobacterlwoffiifrom an aborted equine foetus[J].Veterinarium,1999,10(1):25-26.

[6]蘭亞莉,郎利敏,王亞州,等.兔洛菲不動桿菌感染病例的診斷[J].河南農業科學,2010,38(1):121-123.

LAN Y L,LANG L M,WANG Y ZH,etal.Diagnosis ofAcinetobacterlwoffiiin the cases of rabbit infection [J].JournalofHenanAgriculturalSciences,2010,38(1):121-123(in Chinese).

[7]ZAVROS Y,RIEDER G,FERGUSON A.Gastritis and hypergastrinemia due toAcinetobacterlwoffiiin mice[J].InfectionandImmunity,2002,70(5):2630-2639.

[8]葉雪平,羅毅志,施偉達,等.美國青蛙“抽搐癥”搐病原及防治研究[J].淡水漁業,2005,35(5):48-50.

YE X P,LUO Y ZH,SHI W D,etal.The pathogen research and prevention of “convulsion” in frog [J].FreshwaterFisheries,2005,35(5):48-50(in Chinese).

[9]DUCHATEL J P,JANSSENS D,VANDERSANDEN F .Arthritis in a racing pigeon (Columbia livia),associated toAcinetobacterlwoffii[J].AnnalesDeMedecineVeterinaire,2000,144(3):153-154.

[10]濮本恒,華群.97株洛菲不動桿菌的分布及耐藥分析[J].中國廠礦醫學2009,22(6):714-715.

PU B H,HUA Q.Distribution and drug resistance of 97 strains ofAcinetobacterlwoffii[J].ChineseMedicineofFactoryandMine,2009,22(6):714-715(in Chinese).

[11]甘丹.重慶地區老年人洛菲不動桿菌下呼吸道感染的耐藥性變遷[J].重慶醫學,2009,38(7):808-810.

GAN D.Drug resistance changing ofAcinetobacterlwoffiiabout respiratory infection with the elderly in Chongqing area [J].ChongqingMedicine,2009,38(7):808-810(in Chinese).

[12]龐雪云,田碧文,孫蕾,等.17例多重耐藥洛菲不動桿菌感染的實驗和中西醫結合治療分析[J].實用醫技雜,2006,13(9):1431-1432.

PANG X Y,TIAN B W,SUN L,etal.Analysis on the resistance of cin experiment and inclinical two-drug combination regimen[J].JournalofPracticalMedicalTechniques,2006,13(9):1431-1432 (in Chinese with English abstract).

[13]BECEIRO A,DOMINGUEZ L,RIBERA A,etal.Molecular characterization of the gene encoding a new AmpC β-lactamase in a clinical strain ofAcinetobactergenomic species[J].AntimicrobAgentsChemother,2004,48(4):1374-1378.

[14]單斌,馬曉波,涂亮,等.分析9 年不動桿菌院內感染的耐藥性變化及其與Ⅰ類整合子的相關性[J].實用檢驗醫師雜志,2011,3(1):5-8.

CHAN B,MA X B,TU L,etal.Analysis on variation of drug-resistance during 9 years and relation between drug- resistance and integron I ofAcinetobacter[J].ChineseJournalofLaboratoryPathologist,2011,3(1):5-8(in Chinese with English abstract).

Received 2015-12-18Returned2016-01-08

First authorLIN Jie,female,master student. Research area:prevention and control of animal disease. E-mail qielinjie2009@163.com

(責任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Identification and Drug-resistance Analysis ofAcinetobacterlwoffiiIsolated from Dairy Raw Milk

LIN Jie,WANG Xurong,WANG Lei,WANG Hairui,ZHU Yonggang,YANG Zhiqiang,LI Jianxi and ZHANG Jingyan

(Engineering&Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730050,China)

AbstractIn this study,29 samples of dairy raw milk milk with normal appearance were tested for the milk quality and the bacteriology inspection. The bacteria was isolated from the normal milk sample and identificated by the 16S rDNA sequence analysis,and then,the sensitivity test of 14 kinds of antibiotics was performed. The results showed that among 29 milk samples,10 milk samples contained bacteria,and Acinetobacter lwoffii was isolated from 4 milk samples. The sensitive of antibiotics test indicated that Acinetobacter lwoffii was resistant to cotrimoxazole. The milk composition showed that these 4 milk samples had higher somatic cell count(SCC)than the other samples,while the other composition and the physical and chemical properties were similar to other milk samples.

Key wordsAcinetobacter lwoffii; Identification; Drug-resistance; Milk quality

收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-01-08

基金項目：“948”項目(2014-Z9)；國家奶牛產業技術體系(CARS-37-06)；公益性行業專項(20130304)。

通信作者：張景艷，女，助理研究員，研究方向為中獸醫藥學與免疫學。E-mail:ZWZh1223@126.com

中圖分類號S852.61

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)06-0811-05

Foundation item“948” Project(No.2014-Z9); Dairy Industry Technology and Systems Projects (No.CARS-37-06); Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (No.20130304). ZHANG Jingyan,female,assistant research fellow. Research area:Chinese veterinarian medicine and immunology.E-mail：ZWZh1223@126.com

網絡出版日期：2016-06-01

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0914.006.html

第一作者：林杰，女，碩士研究生，從事動物疾病預防與控制相關研究。E-mail：qielinjie2009@163.com