豬繁殖與呼吸綜合癥病毒結構蛋白GP5-M腺病毒載體的構建及其在山羊乳腺中的表達

蘭　輝 ，卓偉偉，劉　軍，羅　艷，權富生，華　松

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌　712100)

豬繁殖與呼吸綜合癥病毒結構蛋白GP5-M腺病毒載體的構建及其在山羊乳腺中的表達

蘭輝 ，卓偉偉，劉軍，羅艷，權富生，華松

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌712100)

摘要豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)是嚴重威脅養豬業的病毒性疾病，疫苗免疫是預防該病的最有效途徑，PRRSV糖蛋白GP5和基質蛋白M融合后制成的基因工程疫苗能夠有效激發機體產生免疫應答。通過在 GP5和M基因的5′ 端依次加上組氨酸標簽序列、信號肽序列，利用Linker(GP)序列將 GP5和M基因連接構建融合表達GP5和M蛋白的重組質粒pMD18T-SignalP-His- GP5-M。以該質粒為模板，構建重組腺病毒載體并包裝腺病毒。結果表明，用包裝的腺病毒感染乳腺上皮細胞，測得最佳感染復數(MOI)為25，定量PCR和Western blot方法均檢測到 GP5-M的表達。大量擴增腺病毒并使用不連續氯化銫濃度梯度離心純化病毒，使用純化的病毒灌注山羊乳腺，采用Western blot在收集的乳汁中也檢測到GP5-M蛋白的表達。結果證實，利用腺病毒載體作為基因轉導的媒介，在山羊乳腺中可以表達GP5-M融合蛋白。

關鍵詞豬繁殖與呼吸綜合癥；腺病毒載體；GP5-M蛋白；山羊乳腺

豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，又稱豬藍耳病，是由于豬感染繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRS virus,PRRSV)引發的，臨床癥狀主要表現為各年齡段豬嚴重的呼吸系統障礙，母豬流產，仔豬高死亡率等[1]，該病毒已嚴重威脅到全球養豬業的健康發展，并造成嚴重的經濟損失[2]。因此，豬藍耳病是當前養豬行業中亟需預防的病毒性疾病之一。研究表明[3]，PRRSV對豬的免疫系統是一把雙刃劍：一方面，由于PRRSV能夠特異性的結合免疫細胞，特別是巨噬細胞，一旦PRRSV廣泛復制就會導致免疫系統受到抑制，造成多種傳染病疫苗的免疫失敗；另一方面，由于病毒感染刺激機體的免疫系統，機體產生免疫力，會保護機體免受二次感染。近些年，中國PRRS疫情一直很嚴重，2006年的PRRS疫情迫使中國農民宰殺數百萬頭豬，進而導致中國的通脹率達到過去10 a中的最高水平[4]。由于目前沒有針對PRRS的有效藥物[5]，疫苗研究和開發就成為預防和治療豬藍耳病的首要選擇[6]。當前市場上用于預防PRRS的疫苗有滅活苗和弱毒苗，雖然這些疫苗在預防和控制PRRS上發揮一定的作用，但由于PRRSV特殊的感染機制，接種滅活苗和弱毒苗存在很大的安全隱患[7]。在研究PRRS疫苗方面，許多研究人員傾向于在破壞病毒增殖的基礎上將特異性引起機體產生免疫保護的病毒結構成分挑選出來作為疫苗研究和開發的抗原材料。已有報道指出，GP5和M蛋白在病毒的整個生存周期中都是必要的[8-9]，同時它們與中和抗體的產生、細胞免疫、個體保護也密切相關[10-11]。Meulenberg等[12]利用復制缺陷型腺病毒單獨表達GP5或M蛋白或將兩者融合表達，并在小鼠模型中檢測這些蛋白的免疫原性，發現免疫表達GP5和M融合蛋白的重組腺病毒小鼠產生的中和抗體滴度顯著高于免疫單獨表達GP5或M蛋白的重組腺病毒小鼠產生的中和抗體滴度。因此，融合表達GP5和M蛋白成為研發預防PRRS高效疫苗的新方向。

近年來，與PRRSV GP5-M相關的疫苗研究報道越來越多，GP5-M融合蛋白能提供給機體相對于傳統疫苗更高的保護性，但目前還難以實現規模化生產。在轉基因動物組織中表達重組蛋白并將它們分泌到體液中的技術已經被開發利用[13-14]，乳腺生物反應器已被確定為生產重組蛋白的重要選擇[15]。在乳腺上皮細胞中合成的異源蛋白會分泌到乳汁中，這些蛋白可以使用相對簡單的層析系統進行純化[16]。腺病毒載體可以將基因轉移到靶細胞，卻不整合到宿主細胞基因組中，基因的表達不會受到整合位點的負面影響[17]。因而，這些載體已被廣泛地用于許多基因治療研究并取得成功[18]。在乳腺中使用腺病毒感染的方法表達外源蛋白，在小鼠和山羊已經實現高于0.3 g/L的量。所以，利用轉基因動物的乳腺生產重組蛋白具有較大優勢。基于此，本研究利用腺病毒載體作為基因轉導的媒介，在山羊乳腺中進行PRRSV糖蛋白GP5-M的表達，為下一步GP5-M蛋白在真核細胞體內大量表達、收集純化、免疫驗證、疫苗生產等奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物及樣品采集與處理試驗所涉及到的組織樣品均獲自西北農林科技大學克隆羊動物基地，試驗用3只健康關中奶山羊均處于泌乳期，樣品采集和處理參照文獻[19]進行。

1.1.2主要試劑質粒純化試劑盒購自promega公司，脂質體2000購自invitrogen公司，反轉錄試劑盒、T4DNA連接酶、單克隆鼠源抗His標簽一抗、山羊抗小鼠二抗購自北京全式金生物技術有限公司，DNA連接試劑盒購自TaKaRa公司，限制性內切酶購自北京NEB公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Axygen公司，質粒小量抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，氯化銫購自上海阿拉丁公司。

1.2方 法

1.2.1重組腺病毒載體pBHG-SignalP-His- GP5-M的構建用Linker(GP)序列將 GP5和M基因(基因片段由河南農業大學張改平院士課題組饋贈，為不含信號肽的部分序列)連接在一起組裝成 GP5-M基因片段，在 GP5-M基因片段的5′ 端依次加上組氨酸標簽、信號肽序列，組裝成SignalP-His- GP5-M片段，隨后根據設計的引物(表1)，通過PCR在該片段的5′ 端添加EcoRⅠ酶切位點，3′ 端添加NotⅠ酶切位點，同pMD18T進行連接構建pMD18T-SignalP-His- GP5-M載體，將該載體同腺病毒穿梭質粒pHBAd-CMV-IRES-GFP雙酶切構建重組質粒pBHG-SignalP-His- GP5-M(圖1)。

表1　用于擴增 GP5-M的引物

注：小寫字母表示酶切位點。

Note:Lowercase letters indicate restriction site.

圖1　pBHG-SignalP-His- GP5-M質粒結構

1.2.2重組腺病毒的包裝和奶山羊乳腺上皮細胞最佳感染復數(MOI)測定將HEK293A細胞接種于60 mm培養皿中，使用含φ=10%胎牛血清的DMEM細胞培養液培養至70%～80%匯合度時，用Lipofectamine2000轉染重組質粒pBHG-SignalP-His- GP5-M，參照文獻[20]在HEK293A細胞中進行腺病毒的包裝、擴增、濃縮、滴度測定。將獲得的腺病毒命名為rHAd-SignalP-His- GP5-M。將生長良好的乳腺上皮細胞計數后每孔1×104個細胞接種于96孔細胞板，待細胞達到70%左右匯合度時，分別按MOI=5、25、35、50 將腺病毒rHAd-SignalP-His- GP5-M加入96孔細胞板，每個感染劑量做3個重復，并設置培養液陰性對照。72 h后于熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光量及細胞生長狀況(每24 h更換1次培養液)，確定最佳感染劑量。

1.2.3 GP5-M mRNA水平和蛋白水平的檢測

將生長良好的奶山羊乳腺上皮細胞(Mammary epithelial cells,GMECs)接種于12孔板，待細胞生長至70%～80%匯合度時，按MOI=25用腺病毒rHAd-SignalP-His- GP5-M感染GMECs。試驗設對照組(感染pHAd-GFP)、試驗組(感染rHAd-SignalP-His- GP5-M)、空白組(等量培養液)，每個處理組3個重復。細胞處理48 h后收集提取總RNA，反轉錄成cDNA；并以該cDNA為模板采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測 GP5-M基因的表達，引物參照表2。將同樣處理的細胞經加有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解后制成蛋白上樣液，以單克隆鼠源抗His標簽抗體作為一抗，辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG(H+L)抗體作為二抗，通過Western blot檢測GP5-M蛋白的表達水平。

表2　qPCR引物信息

1.2.4腺病毒的大量擴增、收集和純化用腺病毒rHAd-SignalP-His- GP5-M感染狀態良好(70%左右匯合度)的接種于60 mm皿中的HEK293A細胞，3 d后觀察細胞的綠色熒光表達是否出現空斑形成、是否細胞變圓脫落、細胞核是否變大等細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE)，若無此現象，繼續培養直至出現上述癥狀后收集病毒。

收集擴增病毒的細胞，600 r/min離心5 min，棄上清后加入最小體積病毒保存液(一般為原始體積的1/10)重懸細胞。-70 ℃/37 ℃連續凍融4次，冷凍和融化要持續在5 min以內，每次解凍后都要渦旋，使細胞團塊完全重懸，以便細胞冷凍更徹底、破碎更完全。隨后 12 000 r/min室溫離心10 min，收集上清。

將病毒懸浮于10 mL 1.10 g/mL的CsCl溶液。在制備的CsCl梯度溶液(2.0 mL 1.40 g/mL的CsCl溶液中緩慢加入3.0 mL 1.30 g/mL的CsCl溶液)中加入5 mL的病毒懸浮液，20 000 r/min室溫離心20 min。收集1.30 ～1.40 g/mL的病毒條帶至透析袋中(透析袋使用前用10 mmol/L的EDTA-Na2煮沸10 min)4 ℃過夜，中間換1次透析液。收集病毒，測定病毒滴度。

1.2.5His-GP5-M蛋白在奶山羊乳腺中的表達參考文獻[21]的方法，選擇3只1歲齡健康薩能奶山羊,連續2周每天注射荷爾蒙誘導乳腺發育和泌乳。隨后每個乳腺灌注滴度為1.0 ×1010TU/mL的腺病毒和含36 mmol/L EGTA的PBS(pH=7.6)至乳腺最大容量。另外1只灌注不相關的腺病毒(pHAd-GFP)作為對照組，1只灌注不加病毒的PBS作為空白對照組。灌注前擠空乳腺中的乳汁，灌注后1 d擠盡乳腺中的乳汁，在灌注后2 d開始收集所有山羊的乳汁。

1.2.6乳汁His-GP5-M蛋白檢測將收集的乳汁4倍稀釋于乳汁分離緩沖液中(10 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L CaCl2,pH =8.0)，冰上放置30 min后10 000 r/min、4 ℃離心30 min，棄去脂肪層，乳清用酪蛋白沉淀法進行分離，純化的乳清制成蛋白上樣液后通過Western blot檢測His-GP5-M蛋白的表達。

2結果與分析

2.1重組腺病毒載體pBHG-SignalP-His- GP5-M的構建

用EcoRⅠ和NotⅠ酶切pBHG-SignalP-His- GP5-M質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約9 000 bp 的載體條帶和1 221 bp的目的基因條帶(圖2)，測序結果與 GP5和M基因克隆的測序結果一致，表明重組腺病毒穿梭載體構建成功。

M.Trans15K@DNA marker；1. pBHG-SignalP-His- GP5-M質粒的EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定pBHG-SignalP-His- GP5-M digested byEcoRⅠ andNotⅠ

圖2 pBHG-SignalP-His- GP5-M的雙酶切鑒定

Fig.2Double digestion identification of pBHG-SignalP-His- GP5-M

2.2重組腺病毒包裝和奶山羊乳腺上皮細胞最佳感染復數(MOI)確定

轉染2 d后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到少量綠色熒光蛋白表達(圖3-A)，8 d時細胞中的綠色熒光量明顯增多，并出現CPE現象，可看到細胞層出現空洞(圖3-B)，10 d時培養皿中的大部分細胞變圓脫落、崩解，此時收集細胞，反復凍融3次后得到第1代腺病毒(圖3-C)。被病毒感染的HEK293A細胞3 d后出現明顯的CPE現象，通過TCID50法測定得到腺病毒的滴度為1.0×1011TU/mL，達到要求滴度。不同劑量的腺病毒感染乳腺上皮細胞3 d，綠色熒光表達和細胞形態都正常(圖4-B1)，并通過觀察熒光強度和細胞形態發現MOI=25的病毒劑量為最佳病毒接種量(圖4-B3)。

A～C.依次為rHAd-SignalP-His- GP5-M重組腺病毒感染HEK293A細胞2、8和10 d的綠色熒光圖片Fluorescence of HEK293 cell after transfeced rHAd-SignalP-His- GP5-M recombinant adenovirus for 2 d,8 d and 10 d,respectively；A.2 d時有少量綠色熒光表達且熒光強度弱Slight green fluorescence observed at 2 d；B.8 d時綠色熒光量明顯增多，并出現細胞病變效應，同時可看到細胞層出現空洞(圖中紅色箭頭) Massive green fluorescence and CPE observed at 8 d,at the same time the empty cell layer appeared (Red arrows in Figure B)；C.10 d時細胞變圓、脫落(圖中藍色箭頭) Cells round up and detach from the plate at 10 d (Blue arrows in figure C)；D.高滴度的腺病毒感染HEK293A細胞3 d時的綠色熒光，可看到細胞幾乎完全變亮同時細胞層也出現空斑Fluorescence microscopic image of HEK293 cell 3 d after infection of high titer adenovirus,cells almost completely brighten and the cell layer was also observed plaque

圖3轉染重組質粒pBHG-SignalP-His- GP5-M的HEK293A細胞綠色熒光圖(×100)

Fig.3Green fluorescence image of transfected recombinant plasmid pBHG-SignalP-His- GP5-M HEK293A(×100)

2.3His- GP5-M mRNA水平和蛋白水平表達檢測

qPCR結果表明，試驗組 GP5-M基因的mRNA大量表達，而對照組、空白組未檢測到表達(圖5)。Western blot結果顯示，在預期表達His-GP5-M融合蛋白的45 ku處出現明顯的蛋白印跡條帶，與預期His- GP5-M融合蛋白大小一致，表明目的蛋白成功表達(圖6)。

2.4腺病毒的大量擴增

收集出現CPE現象的細胞，-80 ℃和37 ℃反復凍融4次釋放病毒，通過不連續CsCl密度梯度離心法得到1條粉白色條帶，透析去除鹽離子后，測出病毒滴度為1.0×1013TU/mL。

B1. 接種腺病毒3 d后的乳腺上皮細胞GMECS infected with adenovirus for 3 d；B2～B5. 依次為MOI=5、25、35、50 4個感染復數的腺病毒感染乳腺上皮細胞 Four GMECS infected with MOI respectively at which the MOI was 5,25,35,50；B2. 熒光最弱The weakest green fluorescence；B3. 細胞熒光最亮且死細胞少The brightest cell fluorescence and few dead cells；B4～B5. 細胞出現死亡Cell death occured；B6. 空白對照 Blank control

圖4 接種腺病毒3 d的山羊乳腺上皮細胞(×40)

Fig.4Green fluorescence image of GMECS inoculated by adenovirus for 3 d(×40)

圖5　His- GP5-M mRNA水平的相對表達量

a. 感染pHAd-SignalP-His- GP5-M的山羊乳腺上皮細胞pHAd-SignalP-His- GP5-M infected GMECs；b.山羊乳腺上皮細胞空白對照Control of GMECs；c. 感染pHAd-GFP的山羊乳腺上皮細胞pHAd-GFP infected GMECs； d.25 ku帶His標簽的蛋白標準品25 ku with His tag protein standard

圖6His-GP5-M的蛋白水平表達

Fig.6 Expression of His-GP5-M protein

2.5乳汁中His-GP5-M蛋白的檢測

腺病毒灌注山羊乳腺48 h后收集乳汁，Western blot鑒定結果表明，在預期的45 ku處出現明顯的蛋白條帶，與His-GP5-M蛋白大小一致，表明利用高滴度腺病毒進行乳腺灌注，可以感染乳腺上皮細胞，乳腺上皮細胞可以分泌目的蛋白(圖7)。

1. 14 ku帶His標簽蛋白標準品14 ku protein standard with His tag；2. 灌注PBS后收集的乳汁The collected milk after Perfusion PBS；3. 正常乳汁Normal breast milk；4.感染pHAd-GFP的乳汁pHAd-GFP infected milk；5.PBS；6. 感染pHAd-SignalP-His- GP5-M的乳汁pHAd-SignalP-His- GP5-M infected milk

圖7山羊乳腺His-GP5-M蛋白檢測結果

Fig.7Western blot detection of His-GP5-M protein in goat mammary gland

3討 論

通過乳腺生物反應器，選擇病毒的衣殼蛋白作為抗原研發新一代基因工程疫苗，首先要解決的便是如何讓胞內的蛋白分泌到胞外以及如何將目的蛋白純化出來。基于此，本研究選擇在抗原蛋白基因的前端添加上便于純化富集的His標簽序列和利于胞外分泌的信號肽序列，同時，添加標簽蛋白也可為抗病毒衣殼蛋白單克隆抗體的檢測提供方便。目前，雖然各國的研究工作者對豬藍耳病疫苗(基因工程疫苗，亞單位疫苗，DNA疫苗)開展大量研究，部分已經進入臨床試驗和臨床應用階段，但在大規模推廣應用上遭遇障礙，究其原因在于生產成本高、投入高、產出低。伴隨乳腺生物反應器的出現，研發新一代低成本、高產出基因工程疫苗成為現實，并且在許多研究中已經取得良好的效果。Cammuso等[22]利用小鼠和山羊的乳腺分別表達2.8和0.3 g/L的人生長因子，Toledo等[23]利用山羊乳腺生物反應器表達2 g/L 的人促紅細胞生成素。

腺病毒介導的超表達技術因其介導基因轉導效率高、靶細胞種類多、同時感染分裂或不分裂的細胞、不會整合到宿主細胞基因組中、不會導致宿主基因組插入突變的危險、對機體無遺傳毒性、無免疫原性、很容易制備高滴度病毒等諸多優點，使其成為研究基因疫苗和基因治療使用最多的病毒載體之一[24]。本研究中為保證GP5-M蛋白的正確表達和方便驗證獲得重組病毒的正確性，選擇雙啟動子控制的穿梭載體pHBAd-CMV-IRES-GFP，CMV啟動子控制GP5-M蛋白的表達，IRES啟動子控制GFP的表達，從而使GP5-M蛋白的表達不受GFP空間折疊和表達量的影響，保證GP5-M蛋白的大量表達和蛋白活性，另外,使用穿梭載體pHBAd-CMV-IRES-GFP構建的重組病毒能夠表達GFP，有利于觀察病毒包裝和對病毒進行定量。用構建的腺病毒pHAd-SignalP-His- GP5-M感染乳腺上皮細胞后，通過定量PCR和Western blot均檢測到His-GP5-M蛋白的表達。后期擴增病毒進行山羊活體灌注，Western blot檢測乳汁中也出現1條明顯的、與預期大小一致的條帶，證明蛋白在山羊乳汁中成功表達，為研制新一代抗PRRSV疫苗提供思路。

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Received 2016-03-25Returned2016-04-12

First authorLAN Hui,male,master student. Research area: animal embryo engineering.E-mail:lanhsa@163. com

(責任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Construction of PRRS GP5-M Adenovirus Vector and Its Expression in Goat Mammary Gland

LAN Hui,ZHUO Weiwei,LIU Jun,LUO Yan,QUAN Fusheng and HUA Song

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100，China)

AbstractPorcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a serious threat to the pig industry and vaccination is the most effective way to prevent it. The vaccine manufactured by fusing PRRSV glycoprotein GP5 and matrix protein M can stimulate body's immune response effectively. Through adding the GP5 tag sequence and signal peptide sequence into the GP5 and M gene sequences 5′-end and using the Linker (GP) sequence to connect GP5 and M gene,the recombinant plasmid of pMD18T-SignalP-His- GP5-M that expresses GP5 and M protein was constructed. Using this plasmid as a template,we constructed and packaged recombinant adenovirus which was then used to infect goat mammary epithelial cells. The best MOI was 25,and the expression of GP5-M were detected by real-time quantitative PCR and Western blot. We amplified adenoviruses and use discrete cesium chloride density gradient centrifugation to purify it,and then used purified adenoviruses to perfuse into goat mammary gland. The expression of GP5-M protein was tested in collecting milk by Western blot. The results confirmed that by using adenovirus as a vehicle for gene transfer,the expression of GP5-M fusion protein can be found in goat mammary gland,which laid the foundation for the research of PRRSV-specific genetic engineering vaccine.

Key wordsPorcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS); Adenovirus vector; GP5-M protein; Goat mammary

收稿日期：2016-03-25修回日期：2016-04-12

基金項目：國家高科技研究發展計劃(2011AA100303)。

通信作者：華松，男，碩士生導師，研究方向為動物胚胎工程。E-mail:hs863@126.com

中圖分類號S858.26

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)06-0804-07

Foundation itemThe National High Technology Research and Development Program of China(No.2011AA100303). HUA Song,male,master supervisor.Research area: animal embryo engineering.E-mail:hs863@126.com

網絡出版日期：2016-06-01

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0914.004.html

第一作者：蘭輝，男，碩士研究生，研究方向為動物胚胎工程。E-mail:lanhsa@163. com