母胎界面抗磷脂抗體-補體激活機制與自發性早產關系的研究*

杜佩英劉寶玲李孜

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母胎界面抗磷脂抗體-補體激活機制與自發性早產關系的研究*

杜佩英①劉寶玲①李孜①

【摘要】目的：探討外周血、胎盤組織中抗磷脂抗體（APA）水平和補體激活機制與自發性早產（SPB）的關系。方法：選取2015年2月-2016年2月本院收治的60例早產分娩產婦作為病例組，另擇同期60例正常分娩產婦作為對照組，使用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定兩組產婦外周血、胎盤組織中抗心磷脂抗體（ACA）、狼瘡樣抗凝物（LA）和抗β2GPⅠ抗體的水平，采用免疫組化方法檢測胎盤組織中的補體系統（包括C3、C5、IgG和IgM）水平。結果：病例組胎盤組織中ACA、LA和抗β2GPⅠ抗體水平較外周血更為靈敏，兩者比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；病例組胎盤組織中C3、C5、IgG和IgM沉積極為顯著，而對照組基本無沉積，兩組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：胎盤組織中的ACA、LA和抗β2GPⅠ抗體指標更能反映SPB病情，補體系統激活與APA誘發SPB過程密切相關。

【關鍵詞】早產； 抗磷脂抗體； 補體系統

①廣州市番禺區何賢紀念醫院 廣東 廣州 511400

Medical Innovation of China，2016，13（16）：056-060

First-author's address：Hexian Memorial Hospital of Panyu District in Guangzhou City，Guangzhou 511400，China

早產（preterm birth）是圍產醫學中的一個重要、復雜而又常見的妊娠并發癥。目前我國將妊娠滿28周至不足37周間分娩定義為早產，在上述期間出生的體重1000～2499 g、身體各器官未成熟的新生兒稱為早產兒，其發生率約5%～15%［1］。75%以上的圍產兒死亡與早產有關，存活的早產兒常合并有嚴重的疾病如：呼吸窘迫綜合征、顱腦發育異常、視力或聽力異常等，不但大量消耗了有限的醫療資源，長遠來看，還給患兒家庭及社會帶來極大的負擔。因此，明確早產的病因病機、針對病因防治早產及延長孕齡是降低圍產兒病殘率和死亡率，提高新生兒素質的主要措施［2-3］。早產根據病因可以分為治療性和自發性兩種：治療性早產為醫源性或復雜的病理產科因素需提前終止妊娠者，占25%；自發性早產（spontaneous preterm birth，SPB）包括未足月分娩發作和未足月胎膜早破，占75%，故SPB的防治是預防早產的重點。由于對早產病因學研究的重視，該領域已取得較大進展，然而，其病因病機復雜，至今仍未完全闡明。近年隨著生殖免疫學研究的進步，早產免疫機制的研究越來越受到重視，大量的研究表明母胎界面免疫系統功能紊亂可能是SPB發生的關鍵原因。早在十多年前，國外學者在有關早產免疫發病機制的研究過程中注意到某些自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡的SPB發生率明顯增高，因此，提出部分不明原因的SPB可能與抗磷脂抗體（antiphospholipid，APA）介導的免疫損傷有關［4］。產科疾病和APA關系極為密切，胎盤是APA攻擊的主要靶器官，當累及子宮胎盤可導致多種病理妊娠發生，如習慣性流產、死胎、先兆子癇、胎兒生長受限及早產［5-9］。然而由于抗磷脂綜合征（APS）病因病機、臨床表現復雜，實驗室檢測方法的限制等，該領域的研究迄今仍存在許多空白，研究結果雖然肯定了APA與病理妊娠的密切關系，但臨床上總是發現外周血APA水平與臨床表現不一致的情況。臨床表現典型但反復血清反應陰性的APS引起研究人員和臨床工作者的重視［10］。患者全身的APA水平也許不能真實反應靶組織局部的APA水平，因此，直接針對靶組織胎盤進行研究可能更直接、更具有臨床意義。目前國內外關于APS與習慣性流產、先兆子癇、胎兒生長受限的研究較多，但關于APS與早產關系的研究鮮有報道。雖然動物模型的研究結果肯定了補體系統激活和APA在早產發病機制中的重要作用，但由于人體實驗數據的缺乏，APA在人體內造成早產的確切機制尚未得到充分闡明。

本研究通過對自發性早產產婦及正常足月分娩產婦進行成組設計的病例對照研究，通過流行病學調查，采用酶聯免疫吸附法測定外周血及胎盤組織勻漿中與臨床表現密切相關的APA、LA與β2GPⅠ，免疫組化法觀察胎盤組織補體C3、C5及免疫復合物IgG、IgM的沉積情況，嘗試從母胎界面補體激活機制的角度探討APA在自發性SPB免疫機制中的作用，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月-2016年2月本院收治的60例早產分娩產婦作為病例組，另擇同期60例正常分娩產婦作為對照組。按照預先設計的危險因素調查表收集研究對象的危險因素，調查主要內容包括一般情況，如年齡、體重、身高、教育水平、經濟水平、不良生活習慣（如吸煙酗酒）等；既往病史情況，如復發性流產、早產、先兆子癇等病理妊娠病史、孕產史等。其中，存在以下病理妊娠史之一者被認為具有病理妊娠病史：（1）既往發生至少1次不能解釋的孕10周或10周以上的胎兒死亡；（2）至少1次因先兆子癇、子癇或嚴重胎盤功能不全導致孕34周或34周以上的早產；（3）既往發生3次或3次以上的孕10周前自發流產。所有患者均簽署了臨床試驗研究知情同意書，兩組在平均年齡、體重、身高方面比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1　兩組產婦一般資料比較

1.2診斷、納入及排除標準

1.2.1診斷標準 根據謝幸等［11］的診斷標準，妊娠滿28周至不足37周間分娩者，判斷為早產；妊娠滿37周至不滿42足周期間分娩者，判斷為足月產。根據末次月經時間和妊娠20周以前的B超結果確定孕周。

1.2.2納入標準 （1）根據診斷標準診斷為早產的患者；（2）各項生命體征基本平穩。

1.2.3排除標準 （1）年齡＜18歲或＞40歲；（2）平時月經不規則或末次月經不清，又缺乏B超檢查資料而難以精確估計孕齡者；（3）剖宮產手術分娩者；（4）合并嚴重內科合并癥、產科并發癥和生殖道畸形者；（5）近期合并急性全身性或生殖道感染性疾病者；（6）羊水過多或多胎妊娠等導致子宮過度膨脹者；（7）宮頸機能不全者；（8）胎兒畸形者；（9）吸煙、酗酒、吸毒或長期服藥者；（10）既往曾接受輸血、器官移植或免疫治療者。

1.3方法

1.3.1標本采集及處理 （1）血液標本的采集及處理：兩組產婦在胎兒娩出后抽取肘靜脈血5 mL，靜置30 min后2000 r/min離心10 min，取上清液，過濾除菌，-20 ℃保存，待測抗ACA、LA及β2GPⅠ抗體；（2）胎盤組織的采集及處理：胎盤娩出后立即于臍帶附著處避開明顯梗死區、鈣化區，剪取胎盤母面的幾個絨毛小葉，4 ℃生理鹽水沖洗干凈，吸干水分，以制備胎盤勻漿。另同時剪取約20 mm×20 mm×20 mm大小的全層胎盤組織，用生理鹽水反復漂洗后，將絨毛和漂洗后的胎盤組織置入4%中性多聚甲醛中固定，以備免疫組化檢查；（3）胎盤組織勻漿的制備：將采集的新鮮胎盤組織用預冷的25 mmol/L、pH 7.4的PBS充分漂洗，吸干水分，稱取500 mg，加入2 mL PBS，置勻漿機上制成勻漿，2000 r/min離心20 min，取上清液-20 ℃保存，待測ACA、LA及抗β2GPⅠ抗體。

1.3.2指標測定 （1）ACA、LA及抗β2GPⅠ抗體水平測定：采用酶聯免疫吸附法（ELISA）分別檢測兩組產婦外周血及胎盤組織勻漿中的ACA、LA及抗β2GPⅠ抗體水平。陽性結果判斷標準為血清：ACA＞14.9 U/mL，抗β2GPⅠ抗體＞7.8 U/mL，LA比值＞2.0；胎盤組織：ACA＞476.8 U/g，抗β2GPⅠ抗體＞24.18 U/g，LA比值＞2.0［12］。（2）胎盤組織免疫組化檢查：將預先放置4%中性多聚甲醛中固定的胎盤組織進行石蠟包埋，制成5 μm厚的連續切片，貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，經HE染色，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（SP）標記ACA（1∶200）、LA（1∶50）和β2GPⅠ（1∶100），所有抗體購自于Abcam公司，使用Imge-Pro Plus 6.0分析表達強度，參照Remmele and Stegnerde的IRS（immuno-reactivescore）法評價補體C3、C5和免疫復合物IgG、IgM的沉積情況，4分以上為陽性。

1.4統計學處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1外周血清及胎盤組織勻漿中抗ACA、LA及β2GPⅠ抗體水平檢測結果 病例組胎盤組織中ACA、LA和抗β2GPⅠ抗體水平較外周血更為靈敏，兩者比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。除外周血LA外，其余各項指標兩組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.2胎盤組織C3、C5、IgG、IgM免疫組化陽性檢查結果 病例組胎盤組織中C3、C5、IgG和IgM沉積極為顯著，而對照組基本無沉積，兩組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3，兩組胎盤組織免疫組化染色見圖1。

表2　兩組產婦外周血、胎盤組織勻漿中ACA，LA和β2GPⅠ陽性檢測結果比較　例（%）

表3　兩組C3、C5、IgG、IgM免疫組化陽性檢查結果比較　例（%）

圖1　兩組胎盤組織免疫組化染色圖片

3　討論

本研究對自發性早產產婦及正常足月分娩產婦各60例進行了對照研究，研究結果顯示，不良生活習慣和病理妊娠史是誘發SPB的兩個重要的危險因素，這與相關流行病學報道的結論一致［13］。SPB產婦外周血中LA抗體陽性檢出率不靈敏，ACA和β2GPI抗體檢出率有一定顯著性，因此從臨床研究的角度證實了SPB與外周血ACA、LA和β2GPI的相關性存在著一定的爭議性［14］。進而，在SPB產婦的胎盤組織的檢測中，筆者首次發現ACA、LA和β2GPI抗體陽性率顯著升高，而正常產婦陽性發生率極低，這說明胎盤組織中的ACA、LA和β2GPI抗體水平更能準確反映與SPB關系。另一方面，筆者檢測胎盤補體系統的結果顯示，SPB產婦胎盤組織中補體沉積現象明顯高于對照組，顯示APS誘導SPB機制可能與APS激活產婦補體系統有密切關系，從臨床的角度證實了動物實驗關于補體系統激活與APS的研究結論［15-17］。

APA是一組能識別多種含有磷脂結構的抗原物質并與其結合的自身免疫性抗體，具有多種不同類型的靶抗原。根據APA識別的靶抗原不同如識別磷脂（如心磷脂）或磷脂結合蛋白（如β2糖蛋白Ⅰ），分別稱之為抗心磷脂抗體（ACA）或抗β2糖蛋白Ⅰ抗體（anti-β2GPⅠ）。LA是一種磷脂依賴的病理性循環抗凝物質，在體內通過識別磷脂，結合凝血酶原，抑制抗凝血過程，促進血栓形成［18］。因此，前期該領域的研究大多以ACA和/或LA作為觀察指標。而β2GPⅠ是最主要血漿磷脂結合蛋白，其結構中既有磷脂結合位點，又存在APA結合區，能高親和力地結合磷脂后形成磷脂β2GPⅠ復合物，使β2GPⅠ構型改變，暴露出能被APA識別的表位，然后APA才與此復合物作用。ACA、LA并非直接作用于磷脂，而是可能通過和磷脂/β2GPⅠ復合物結合后產生APA，APS的主要病理改變是由磷脂/β2GPⅠ復合物及其抗體引起的［19］。在此基礎上，筆者的研究進一步證明胎盤組織中的ACA、LA和β2GPⅠ抗體水平更能準確反映與SPB的關系。目前關于APA影響妊娠過程的確切機制尚不清楚，一般認為APA導致病理妊娠與其導致母胎界面上微血栓形成有關。然而，在對APS患者胎盤、絨毛組織等進行病理分析時，發現胎盤中并沒有明顯的血栓形成，而是有大量的免疫復合物沉積于絨毛滋養細胞胞漿和絨毛血管壁上，因而補體系統的過度活化可能是APS患者病理妊娠的中心機制［4］。有學者推測APA可能是通過過度激活胎盤的補體系統，導致大量的補體活化產物C3a和C5a產生，在胎盤局部募集炎性細胞，并釋放血管活性物質，導致胎盤組織局部炎性反應、血栓形成及組織缺氧，最終導致病理妊娠的發生［6，16］。筆者的研究結果進一步從臨床的角度證明了APA誘導早產的病理機制與母胎界面的補體系統的活化密切相關。動物實驗研究發現，在被動轉移人類APA建立的小鼠模型中，分別給予肝素類和其他抗凝血藥物，結果發現低分子肝素顯著降低流產及早產發生率，在只利用具有抗凝作用而無補體抑制的抗凝血藥時，并不能抑制流產和早產的發生［4］。動物模型實驗研究證實了補體系統激活和APA在早產發病機制中的重要作用，補體系統的過度激活是APA導致早產的機制之一。在此基礎上，筆者的研究表明APA陽性孕婦的早產風險顯著增加，并且APA導致早產的病理過程與母胎界面補體系統的激活密切相關，可能是APA誘導早產的核心病理機制。

本研究不但聯合檢測目前被認為與臨床表現的關系最為密切的三種抗磷脂抗體（抗β2GPⅠ抗體、ACA和LA）水平，增加了抗體的檢出率及檢測的準確率；而且首次直接檢測胎盤組織勻漿中三種抗體水平，并與外周血中的抗體水平比較，直接闡明檢測胎盤組織中的抗體水平較檢測外周血中的抗體更具有臨床意義，合理解釋了臨床經常出現血清抗體水平與臨床表現不一致的現象，為進一步開展母胎界面APA水平與其他病理妊娠關系的研究提供新的科研思路和科研方向。同時，也為更深入、全面了解SPB的免疫機制提供科學的臨床研究數據，為今后針對APA介導的補體系統激活機制預防和治療早產提供科學依據［20-21］。

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Study on the Maternal Fetal Interface of Antiphospholipid Antibodies and Complement Activation Mechanisms of Spontaneous Preterm Birth

DU Pei-ying，LIU Bao-ling，LI Zi

【Key words】Premature delivery； Antiphospholipid antibodies； Complement system

【Abstract】Objective：To investigate the relationship between the level of anti phospholipid antibodies （APA） and complement activation in peripheral blood and placental tissues and spontaneous preterm birth （SPB）. Method：From February 2015 to February 2016，60 premature delivery woman in our hospital were selected as the case group and another 60 normal delivery women as the control group，two groups of peripheral blood and placental tissue with anticardiolipin antibody （ACA），lupus like anticoagulants （LA） and anti β2GPⅠ antibody level were determined by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA），the complement system （including C3，C5，IgG and IgM） in placental tissues was detected by immunohistochemistry method.Result：The APA，LA andβ2GPⅠlevel of placental tissue in the case group were more sensitive combined with peripheral blood，the differences were statistvcally significant（P＜0.05）.C3，C5，IgG and IgM deposition of placenta tissue in case group were extremely significant，while the control group had no deposition，the differences were statistvcally significant （P＜0.05）.Conclusion：The ACA，LA and β2GPⅠ antibody indexes of placenta tissue can reflect the condition of SPB，complement system activation is closely related to the APA induced SPB process.

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.16.016

*基金項目：2015年番禺區區級醫療衛生預立項目（2015-Z03-53）

通信作者：杜佩英

收稿日期：（2016-03-31） （本文編輯：李穎）