中性粒細胞堿性磷酸酶染色陽性對照品設計*

蔣朝暉， 馬千里， 陳　俊， 張　潔， 余紅嵐

(貴陽市第一人民醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽　550002)

中性粒細胞堿性磷酸酶染色陽性對照品設計*

蔣朝暉， 馬千里， 陳俊， 張潔， 余紅嵐*

(貴陽市第一人民醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽550002)

[摘要]目的： 探討EDTA-K2抗凝外周血作為中性粒細胞堿性磷酸酶(NAP)染色陽性對照的可能性。方法： 選取EDTA抗凝的NAP積分正常外周靜脈血及NAP積分明顯升高外周血，各制成200張血片，分為積分正常組和積分升高組，這兩組又再分為不固定組和固定組(用10%甲醛—甲醇固定)；每隔5 d每組取10張血片進行NAP染色，共計50 d染色10次，比較各組NAP陽性率及積分。結(jié)果： 每組血片中NAP活性隨著時間推移而減弱，積分明顯升高的外周血NAP活性能維持到40 d，10%甲醛-甲醇固定的血片酶活性下降相對緩慢。結(jié)論： 選用NAP積分明顯升高的外周血，經(jīng)10%甲醛-甲醇固定后可作為NAP染色的陽性對照，其有效期約為40 d。

[關(guān)鍵詞]堿性磷酸酶； 粒細胞； 染色與標記； 細菌感染； 血細胞； 質(zhì)量控制

中性粒細胞堿性磷酸酶(neutrophil alkaline phosphatase staining， NAP)染色積分及陽性率的變化,對慢粒與類白、再障與陣發(fā)性血紅蛋白尿、細菌與病毒感染的鑒別診斷、淋巴瘤病理分型及預后具有重要的意義[1-2]。由于NAP染色實驗過程受到試劑有效期、環(huán)境溫度、細胞數(shù)量及孵育時間等各種因素的影響，染色質(zhì)量控制尤為重要。有學者提出NAP染色時可以選擇前1～2 d骨髓檢查無明顯改變和無臨床可疑血液病的標本作為質(zhì)控對照，或選擇骨髓網(wǎng)狀細胞、網(wǎng)狀纖維及骨髓小粒內(nèi)支架成分作為監(jiān)控對象[3]。但這些質(zhì)控對照標本一般難以獲得，且隨機性較大，不利于實驗室的標準化操作。本研究利用自制的兩種抗凝外周血片作為NAP染色的陽性對照，通過不同方式處理,摸索該陽性對照標本的保存時間及保存條件，探討其作為NAP染色陽性對照的可行性。

1材料與方法

1.1材料

所有標本均來源于門診病例中NAP積分正常及細菌感染導致NAP積分明顯升高的EDTA-K2抗凝外周血，采用中性粒細胞堿性磷酸酶染色液(NAP)套組(試劑Kaplow偶氮偶聯(lián)法，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1血片制備選取NAP積分正常及細菌感染導致NAP積分明顯升高的EDTA-K2抗凝血各3 mL。NAP積分正常組白細胞計數(shù)(WBC)為(9.2±0.3)×109/L，中性桿狀粒細胞+中性分葉粒細胞占70%，NAP陽性率42%，積分58分；NAP積分明顯升高組WBC 為(25.3±1.2)×109/L，中性桿狀粒細胞+中性分葉粒細胞占86%，NAP陽性率80%，積分120分。所有血液標本分別制成200張血片，分為NAP積分正常組和NAP積分升高組，NAP積分正常組和NAP積分升高組又再分為不固定組和固定組(用10%甲醛—甲醇固定)，每隔5 d每組取10張血涂片進行NAP染色，共計50 d染色10次。比較4組涂片的NAP陽性率和積分的變化。

1.2.2NAP染色染色步驟嚴格按照試劑說明，血片干燥后，滴加固定液0.5 min，蒸餾水沖洗，甩干；滴加(偶氮、亞硝酸鈉、磷酸萘酚AS-BI)工作液處理15 min，蒸餾水沖洗，甩干，核固紅復染1～2 min，干燥后鏡檢。結(jié)果判斷標準：(-)為0分，細胞漿中無陽性染色顆粒；(+)為1分，細胞漿中含少量顆粒或呈彌漫淺藍色；(++)為2分，細胞漿中含中等量顆粒或彌漫藍色；(+++)為3分，細胞漿中含較多顆粒或呈彌漫較深藍色；(++++)為4分，細胞漿中充滿粗大顆粒或呈彌漫深藍色。每張血片計數(shù)100個中性桿狀及分葉粒細胞，記錄其陽性率及積分。

1.2.3驗證EDTA-K2抗凝劑對NAP活性的影響選取血常規(guī)檢測正常的血標本10例，利用穿刺針軟管內(nèi)殘留的血液制作EDTA抗凝血片和不抗凝血片，干燥后立即NAP染色，觀察并比較EDTA-K2抗凝劑對血片NAP陽性率及積分的影響。

1.3統(tǒng)計學方法

NAP陽性率及積分采用例數(shù)或百分比(%)表示，組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗，多組間多重比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計及圖表制作使用Excel 2007軟件完成。

2結(jié)果

2.1EDTA-K2抗凝劑對NAP活性的影響

通過比較10例抗凝及不抗凝靜脈血NAP染色發(fā)現(xiàn)，不抗凝血片的積分明顯高于抗凝血片差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但NAP陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示抗凝劑EDTA-K2影響NAP積分，但不影響陽性率，見表1。

表1　EDTA-K2抗凝劑對NAP染色陽性率及積分的影響

2.2NAP酶活性與染色時間的關(guān)系

NAP染色結(jié)果顯示，NAP積分正常組NAP酶的活性快速喪失，第20天時固定組無強陽性細胞、未固定組偶見陽性細胞； NAP積分升高組中，NAP酶活性下降相對較慢，在40 d內(nèi)其陽性率無明顯變化，積分略有下降，固定組明顯優(yōu)于未固定組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A、B分別為積分正常組陽性率和積分；C、D分別為積分升高組陽性率和積分圖1　不同處理方式的外周血片NAP染色陽性率和積分Fig.1　Positive rate and scores of peripheral blood pieces with different treatment

3討論

NAP作為一種重要的細胞化學染色，染色積分及陽性率的變化對慢粒與類白、再障與陣發(fā)性血紅蛋白尿、細菌與病毒感染的鑒別診斷的鑒別診斷、淋巴瘤病理分型及預后具有重要的意義[1-2]。曹宇[4]、周建中[5]探討了NAP染色的實驗條件，但目前對于該實驗的質(zhì)量控制則少有報道。《臨床檢驗標準操作規(guī)程》第4版與第3版關(guān)于NAP染色的標準操作改動較大，第3版及相關(guān)試劑說明書指出，NAP染色只能用不抗凝的靜脈血或皮膚穿刺血測定，每次染色應有陽性對照[6]，而第4版對于標本是否抗凝沒有明確要求，并且新提出了使用骨髓細胞作為質(zhì)控對照。鑒于骨髓細胞難以獲得，不利于NAP染色操作的實驗室標準化，本研究采用兩種自制的外周EDTA-K2抗凝外周血制成血片NAP染色作為陽性對照，摸索其保存條件及有效期，初步建立NAP染色的陽性對照質(zhì)控體系的可能性。由于不抗凝血取材、推片存在諸多不便，部分文獻報道可以采用抗凝血代替新鮮血進行NAP染色[7-8]。由于在是否采用新鮮血問題上存在分歧，本研究首先驗證EDTA-K2抗凝劑對于NAP活性的影響。實驗結(jié)果表明，EDTA-K2能輕度抑制NAP的活性，但其陽性率無明顯變化。因此，可采用EDTA-K2抗凝外周血大批量制作NAP染色的陽性對照血片。

曾小菁等[9]指出NAP酶的活性會隨時間延長而降低，如不能及時染色的標本，經(jīng)固定后，一般在1周內(nèi)進行染色。但如果NAP染色的陽性對照血片沒有較長的有效期，將導致每次都需臨時制作陽性血片，操作繁瑣，不利于在臨床應用。因此，摸索陽性對照血片最佳保存條件，盡可能延長其效期，是建立NAP染色質(zhì)控體系的重要環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果表明，因細菌感染導致NAP積分明顯升高的外周血比較正常NAP積分的外周血，其酶活性衰減時間相對延長，如果用10%甲醛—甲醇固定上述外周血片，其酶活性將持續(xù)更長時間達到40 d左右。40 d的時間對于成熟的質(zhì)控品而言，效期不算長，達不到商品化及臨床應用的要求。但陳敬文等[10]研究發(fā)現(xiàn)采用醇性固定劑可對NAP的固定效果及顯示有所改善，下一步將會關(guān)注固定液的選擇。同時，本研究中陽性對照血片保存條件為20 ℃左右的室內(nèi)環(huán)境，低溫環(huán)境(-20 ℃、-70 ℃)是否能延長效期有待進一步研究。

綜上所述，選用NAP積分明顯升高的外周血經(jīng)10%甲醛-甲醇固定后作為NAP染色的陽性對照，其有效期約為40 d，如何延長其效期有待進一步研究。

4參考文獻

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[2] 劉景華，周凡，劉彥琴，等.中性粒細胞堿性磷酸酶染色對淋巴瘤病理分型及病情評估的意義[J].實用醫(yī)學雜志， 2011(23):4210-4212.

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[4] 曹宇.中性粒細胞堿性磷酸酶染色實驗條件探討[J].西南軍醫(yī)， 2010(2):233-234.

[5] 周建中. 底物及偶聯(lián)劑濃度對堿性磷酸酶染色靈敏度的影響[J].廣東醫(yī)學, 2008 (11):1942.

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[8] 沈亞文，王仲泉，鄧寬國.標本采集方法對中性粒細胞堿性磷酸酶染色結(jié)果影響的觀察[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志 ,2003(2)：126-127.

[9] 曾小菁.臨床血液學檢驗實驗指導[M].北京：科學出版社， 2012:25.

[10]陳敬文，張偉，崔華娟，等. 醇溶性固定液在堿性磷酸酶染色中的應用[J]. 華南國防醫(yī)學雜志， 2011(3):199-201.

(2016-03-23收稿，2016-05-28修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

A Preliminary Study on the Design of Positive Control of Neutrophils Alkaline Phosphatase Staining

JIANG Zhaohui, MA Qianli, CHEN Jun, ZHANG Jie, YU Honglan

(ClinicalLaboratory,theFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550002,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the possibility of EDTA-K2 anticoagulant peripheral blood as staining positive control of neutrophil alkaline phosphatase (NAP). Methods: Peripheral venous blood of EDTA anticoagulation with normal NAP score and peripheral venous blood of EDTA anticoagulation with significantly increased NAP integral were selected to make 200 blood pieces, respectively. They were divided into normal NAP score group and increased NAP integral group, and they were further divided into non fixed group and fixed group (fixed by 10% formaldehyde-methanol). Nap staining was performed every other week at 5 d in each of the 10 groups, with a total of 50 d staining for 10 times. NAP positive rates and score were compared between each group. Results: The activity of NAP decreased with time in blood pieces of each group. Peripheral venous blood with significantly increased NAP integral can be maintained for about 40 days. The activity of enzyme in the blood fixed by 10% formaldehyde-methanol decreased relatively slowly. Conclusion: Peripheral venous blood with significantly increased NAP integral after fixed by 10% formaldehyde-methanol can be selected to be staining positive control of NAP, and the effective period is about 40 days.

[Key words]alkaline phosphatase; neutrophil; staining and marking; bacteria infection; blood cell; quality control

*通信作者E-mail:123900828@qq.com

[中圖分類號]R446.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0718-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.022

網(wǎng)絡出版時間：2016-06-16網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1729.054.html