非生物脅迫對擬南芥IQM4基因表達的影響

蕭文慧　宋俊威　黃小玲　周玉萍　田長恩

【摘 要】本文首先以擬南芥IQM4基因為搜索對象，檢索了兩個生物信息數據庫，搜索到IQM4基因對幾種非生物脅迫均能產生應答，并對IQM4基因表達量進行了分析；然后參考數據庫所提供的實驗方法，采用半定量RT-RCR技術驗證了幾種非生物脅迫對IQM4基因表達的影響。結果表明鹽和滲透脅迫均能抑制幼苗期IQM4基因表達，而脫水、低溫和機械損傷早期能增強IQM4基因表達水平。實驗初步證明擬南芥IQM4基因在植物非生物脅迫中發揮重要作用。

【關鍵詞】擬南芥；IQM4；非生物脅迫；基因表達

在植物信號轉導途徑中，Ca2+作為動植物細胞內重要的第二信使，通過Ca2+傳感蛋白及其靶蛋白來調節多種生化和細胞反應。鈣調素（Calmodulin，CaM）是目前最重要的一類胞內Ca2+信號受體。在眾多的CaMs中，除CaM7具有轉錄調控活性外，其它均無任何酶活性，必需與其下游的靶蛋白—鈣調素結合蛋白（calmodulin-binding protein， CaMBP）來調節細胞生理功能[1]。

植物中有5個含IQ基序的鈣調素結合蛋白家族：IQM、Myosin、CNGC、IQD和CAMTA，其中IQM家族由我們發現[2]。擬南芥IQM家族共有6個成員，均含1個IQ基序，N-端具有與豌豆重金屬誘導蛋白6A的同源序列，C-端具有與天花粉素的同源序列。IQM1編碼1個Ca2+不依賴型的CaMBP，影響保衛細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，在氣孔運動中發揮重要作用，IQM1缺失抑制了光誘導的氣孔張開，iqm1突變體表現氣孔開度小和根較短的表型[3]；IQM1過表達株系則表現為氣孔開度大和根較長[4]。IQM4（編號為At2g26190）是IQM家族中與IQM1高度同源的成員[5]，其功能未見報道。為了研究IQM4的基因功能，本文以IQM4基因為搜索對象，檢索了兩個生物資源信息數據庫，搜索到IQM4基因對幾種非生物脅迫均能產生應答；為了驗證生物信息數據庫中IQM4基因表達的數據，本文開展了鹽、甘露醇、脫水、低溫以及損傷處理對IQM4基因表達影響的分析，該研究結果為進一步開展IQM4基因的功能研究提供重要理論依據。

1 實驗材料

實驗所用的擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia（Col）生態型。MS鹽購自Sigma公司，PrimeScript One Step RT-PCR Kit，RNAiso Plus購自TaKaRa公司，NaCl和Manntiol試劑購于上海生工。

2 實驗方法

2.1 擬南芥培養

土壤培養：將經過4℃浸泡3d的吸漲種子直接點種于營養土表面，置于長日照培養室中培養（溫度為22±2℃，光周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為100μmol·m-2·s-1，相對濕度為85%，下同）。

1/2MS培養基培養：取經過4℃浸泡3d的吸漲種子，用75%乙醇浸泡5～10s后棄乙醇，再加入0.1% HgCl2浸泡5min后棄HgCl2，用無菌水漂洗3～4次。最后加入適量的0.3% Agar溶液懸浮，接種到1/2MS培養基上，置于長日照培養室中培養。

2.2 生物信息學數據庫的檢索

以IQM4基因為搜索對象，檢索AtGenExpress Visualization Tool（http：//jsp.weigelworld.or）和Genevestigator Expression Data（https：//www.genevestigator.com），以基因表達改變量為1.5倍為閾值，篩選對IQM4基因表達影響較大的非生物因素作為后續實驗的依據。

2.3 非生物脅迫的處理

滲透脅迫處理：將1/2 MS固體培養基上生長2周的幼苗小心拔出，需保持幼苗的根的完整性，稱取30～50mg幼苗為一個樣品，共稱取6個樣品；將樣品浸沒于300mmol/L甘露醇溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。

鹽脅迫處理：稱取6個2周幼苗樣品，將樣品浸沒于150mmol/L氯化鈉溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。

低溫處理：稱取3個2周幼苗樣品；將樣品置于4℃處理，分別在0.5、1和3h取樣。

脫水處理：稱取3個2周幼苗樣品；將樣品放在濾紙上，并置于長日照培養室中，分別在0.5、1和3h取樣。

損傷處理：先用帶有鋸齒的鑷子夾傷生長在培養基上的2周幼苗，然后置于長日照培養室中，分別在0.25和0.3h取樣。

2.4 IQM4基因的RT-PCR分析

參照RNAiso Plus說明書提取非生物脅迫處理的樣品總RNA。

以IQM4編碼序列的特異引物F1：5-AGTTAGCTC TTCAGCATTGGC-3′和R1：5-TCTTCTTGTTCCTCTGTAACG-3′進行半定量RT-PCR，分析樣品中IQM4的表達水平。實驗以擬南芥β-ATPase基因設計了內標引物F2：5-CTGAATCAATCTCTTAAGCTG-3和R2：5-GTGCAGA AAGTTCTACAGAACTAC-3。RT-PCR采用PrimeScript One Step RT-PCR Kit，每個反應以100 ng總RNA為模板，總反應體積為20 μL，擴增參數為①50℃ 30min，②94℃ 2min，③94℃ 30s，④54℃ 30s，⑤72℃ 40s，③④⑤ 31次循環，⑥72℃ 5min。反應結束后，取擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，并用凝膠成像系統拍照保存。

3 結果與分析

3.1 生物信息數據庫中IQM4基因表達數據分析

本文以擬南芥IQM4為研究對象，檢索了兩個數據庫，搜索到大量IQM4基因表達的數據資料。表1是以IQM4表達量改變倍數在1.5倍以上為標準，整理了幼苗地上組織中IQM4基因表達受到鹽和滲透脅迫、低溫、脫水以及機械損傷等非生物脅迫因子影響的數據。從數據庫的資料（表1）來分析，鹽脅迫1h后明顯抑制了幼苗地上組織中IQM4基因表達；滲透脅迫在0.5～1h內顯著增強了IQM4基因表達量，但3～24h內基因表達變化不明顯；低溫脅迫0.5h內IQM4基因表達量有所下調；脫水和機械損傷能迅速增強IQM4基因表達量。

3.2 幼苗中IQM4基因的RT-PCR分析

采用半定量RT-PCR技術分析幾種非生物脅迫對擬南芥幼苗中IQM4基因表達的影響。

從圖1A可以看出，與對照相比，鹽脅迫初期（0.5和1h），IQM4基因表達明顯上調，隨著鹽脅迫時間的增加（6和12h），IQM4表達量顯著降低，但24h后表達量恢復到對照水平。圖1B顯示，與對照相比較，滲透脅迫0.5～12h期間IQM4表達量逐漸降低，至24h時表達量有所增加，但仍低于對照水平。圖1C顯示脫水處理能增強幼苗中IQM4基因表達量。圖1D顯示低溫處理后，IQM4表達水平呈現先降低（0.5～1h）后升高（3h）趨勢，低溫處理3h后IQM4表達量明顯高于對照。圖1E顯示幼苗遭受機械損傷0.25h后，IQM4基因表達稍有增強，而0.5h后，IQM4基因的表達量急劇降低。從RT-PCR結果來看，不同脅迫因子對幼苗中IQM4基因表達水平產生了不同影響。

4 討論

已知擬南芥IQM家族在植物對光、生物和非生物脅迫反應中發揮重要作用[7]。半定量RT-PCR結果驗證了生物信息數據庫的資料，結果表明擬南芥IQM4基因表達受到鹽和滲透脅迫、脫水、低溫和機械損傷等非生物脅迫因子的影響，初步證明IQM4基因在植物非生物脅迫中發揮重要作用。

實驗發現RT-PCR分析結果與數據庫的數據有部分偏差，如鹽脅迫處理RT-PCR結果是脅迫0.5h和1h后IQM4基因表達明顯上調，而數據庫的資料則為脅迫1h后IQM4表達量顯著降低。RT-PCR結果顯示滲透脅迫明顯抑制IQM4表達，而數據庫的資料則為滲透脅迫0.5h和1h后顯著增強IQM4基因表達量。數據庫的資料顯示機械損傷明顯增強IQM4表達水平，但RT-PCR結果則是表達水平有所下降。我們推測RT-PCR結果與數據庫的資料出現偏差的原因可能是因為實驗材料的取樣部位不一致造成的，數據庫數據的取材為幼苗地上組織，而本實驗是以整株幼苗為實驗材料。

【參考文獻】

[1]韋慧彥，郭振清，崔素娟.鈣不依賴性鈣調素結合蛋白的研究進展[J].生物化學與生物物理進展，2007，34（2）：124-131.

[2]田長恩，周玉萍.植物具IQ基序的鈣調素結合蛋白的研究進展[J].植物學報，2013，48（4）：447-460.

[3]Zhou YP， Duan J， Yamamoto KT， Tian CE. AtIQM1， a novel calmodulin-binding protein， is involved in stomatal movement in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology， 2012， 79（5）： 333-346.

[4]周玉萍，陳瓊華，陳潔珊，程惠貞，田長恩.IQM1基因過量表達對擬南芥氣孔運動及根系生長的影響[J]. 西北植物學報，2013，33（5）：904-910.

[5]Zhou YP， Chen YZ， Duan J，Yamamoto KT， Tian CE. Sequence and expression analysis of the Arabidopsis IQM family[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2010， 32（1）： 191-198.

[責任編輯：楊玉潔]