木賊有效部位抑制氧化低密度脂蛋白誘導的內皮細胞凋亡及LOX-1、NOX4mRNA的表達

李志永　李　玲　李麗瑋　侯建明　甄艷君

(保定市徐水區人民醫院病理科，河北　保定　072550)

木賊有效部位抑制氧化低密度脂蛋白誘導的內皮細胞凋亡及LOX-1、NOX4mRNA的表達

李志永李玲1李麗瑋2侯建明3甄艷君3

(保定市徐水區人民醫院病理科，河北保定072550)

〔摘要〕目的探討木賊有效部位對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-ECV304)凋亡抑制作用的可能機制。方法體外ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞損傷，用木賊有效部位進行干預。采用流式細胞術檢測細胞凋亡率；反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測內皮細胞血凝素樣ox-LDL受體1(LOX-1)mRNA、NADPH氧化酶4(NOX4)mRNA及 Caspase-3 mRNA表達。結果與模型組比較木賊有效部位干預后細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，LOX-1 mRNA、NOX4mRNA及 Caspase-3 mRNA表達明顯下調(P<0.01)。結論木賊有效部位可能通過抑制LOX-1 mRNA及 NOX4 mRNA的表達，實現對凋亡相關基因的調控來減少內皮細胞的凋亡。

〔關鍵詞〕木賊；有效部位；氧化低密度脂蛋白；內皮細胞；凋亡；血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1；NADPH氧化酶

動脈粥樣硬化(AS)起始于血管內皮細胞損傷〔1〕。而內皮細胞過度凋亡則是血管內皮損傷的一種重要形式，被認為是AS的始動步驟〔2〕。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作為主要凋亡誘導因素之一，在AS的發病中起了關鍵作用。血凝素樣ox-LDL受體1(LOX-1)是新近發現的內皮細胞膜上的ox-LDL特異性受體，介導ox-LDL對內皮細胞的病理學作用，NADPH氧化酶(NOX)是內皮細胞產生活性氧的主要酶體，研究證實LOX-1與NADPH氧化酶在介導內皮細胞的損傷及凋亡過程中起重要作用，兩者均與AS的發生發展密切相關〔3,4〕。課題組在離體及在體實驗均證實中草藥木賊提取物具有抑制內皮細胞(EC)凋亡和調控凋亡相關基因表達等多層面機制保護內皮細胞的作用，并初步判定木賊有效藥理活性部位為黃酮及芬酸類化合物〔5,6〕。但其抗內皮細胞凋亡的具體途徑仍不清楚，本實驗旨在通過觀察木賊有效部位干預ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)凋亡和對內皮細胞LOX-1 mRNA及NOX4 mRNA表達的影響，進一步探討木賊有效部位抗凋亡的作用機制。

1材料與方法

1.1材料CO2恒溫培養箱(美國Revco)，756MC型紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，Gen Amp5700型PCR儀(美國PE公司)，FR-200A凝膠掃描系統(上海復日科技有限公司)，微量移液器(美國Eppendorf)，Epics-XLⅡ型流式細胞儀(美國B-C公司)，木賊飲片(購于石家莊市樂仁堂大藥房,經河北醫科大學中醫學院中藥系鑒定)，槲皮素和阿魏酸標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號0080-9705，0773-9910)，D101型大孔樹脂(天津大均科技開發有限公司)，HUVEC-ECV304(武漢大學中國動植物保存中心)，新生小牛血清(四季青公司)，DMEM培養液及胰酶(GIBCO公司)，總RNA提取試劑(TRIzol)、cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒及DNA Marker(均為北京TIANGEN公司)，PCR引物(北京三博遠志生物公司)，其他試劑均為國產分析純。

1.2木賊有效部位的制備稱取適量木賊飲片置于圓底燒瓶中，加12倍量的70%的乙醇浸泡2 h，電熱套加熱回流提取3次，每次2 h，過濾并合并濾液，得木賊提取液。稱取大孔樹脂40 g，將提取液上樹脂柱，先以水沖至洗脫液近無色后(Molish反應陰性)分別用蒸餾水，30%乙醇，70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液作為測試樣品，分別以槲皮素和阿魏酸為對照品用紫外分光光度計檢測此樣品中總黃酮和總酚酸含量并測定其純度。將70%乙醇洗脫液減壓濃縮后，用無血清培養基DMEM將樣品稀釋，以二甲基亞砜(DMSO)使其充分溶解，此為用于本實驗的木賊有效部位。

1.3ox-LDL的制備采用沉淀法參照文獻〔7〕制備。

1.4細胞培養與分組采用15%新生小牛血清DMEM作為培養液,在37℃、5%CO2培養箱中瓶養HUVEC-ECV304。取對數生長期細胞15瓶，將細胞培養液換成無血清DMEM培養液，培養6 h后隨機分成3組①對照組：無血清DMEM培養液；②模型組：無血清DMEM培養液培養1 h后加入ox-LDL，使其終濃度為80 μg/ml；③木賊有效部位組(有效部位組)：無血清DMEM培養液中加入木賊有效部位，使其終濃度為50 μg/ml，培養1 h后加入ox-LDL，使其終濃度為80 μg/ml。繼續培養12 h后收集細胞和培養液進行檢測。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率用胰酶消化收獲細胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，1 500 r/min離心5 min棄上清，細胞用70%冷乙醇固定，置于-20℃保存待測。碘化丙啶(PI)染色后，流式細胞儀檢測內皮細胞凋亡率。

1.6RT-PCR按Trizol試劑盒說明書提取各組細胞總mRNA，經2%瓊脂糖凝膠電泳后，每一樣品均出現清晰的28 S和18 S條帶,且28 S條帶的亮度和寬度約為18 S條帶的2倍，純度鑒定A260/A280值為1.8～2.0。RNA的反轉錄過程及擴增過程分別按試劑盒說明書進行。LOX-1引物序列為：上游5′-TGGGAAAAGAGCCAAGAGAA-3′，下游5′-TGCAGCCAGCTAAATGACAG-3′,擴增產物全長229 bp；NOX4引物序列為：上游5′-CTCAGCGGAATCAATCAGCTGTG-3′，下游5′-AGAGGAACACGACAATCAGCCTTA-3′，擴增產物全長286 bp；Caspase-3引物序列為：上游5′-ATACTCCTTCCATCAAATAG-3′，下游5′-AACATCACAAAACCATAATC-3′，擴增產物全長411 bp；內參GAPDH引物序列為：上游5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，擴增產物全長300 bp。LOX-1反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，51.8℃退火40 s，72℃延伸50 s；NOX4反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s；Caspase-3反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，47℃退火60 s，72℃延伸60 s；GAPDH反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s；以上均30個循環后再72℃延伸5 min。取10 μl反應產物在2%瓊脂糖凝膠(含EB)上電泳，FR-980生物電泳圖像分析軟件分析灰度值，以目的條帶與內參照GAPDH條帶的灰度比值代表目的基因mRNA的表達水平。

1.7統計學處理采用SPSS15.0軟件行單因素方差分析，S-N-Kq檢驗。

2結果

2.1細胞凋亡率流式細胞儀分析結果顯示：模型組細胞凋亡率較對照組顯著升高(P<0.05)。加入木賊有效部位后細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)。見表1。

2.2LOX-1、NOX4及Caspase-3 mRNA表達與對照組比較模型組LOX-1 mRNA、NOX4 mRNA及Caspase-3 mRNA的表達均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比有效部位組LOX-1 mRNA、NOX4 mRNA及Caspase-3 mRNA的表達均顯著降低(P<0.01)。見表1及圖1。

表1　木賊有效部位對內皮細胞凋亡率及LOX-1、NOX4及

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

1～3:對照組；模型組；有效部位組圖1　各組細胞LOX-1、NOX4及Caspase-3 mRNA RT-PCR產物的電泳圖

3討論

木賊中含有黃酮類及芬酸類化合物〔8〕，這兩類物質具有抗炎、抗氧化，保護血管內皮細胞，抑制AS形成的作用。本課題組在前期動物實驗基礎上將木賊有效部位提取的方法加以改進得到含黃酮及芬酸質量分數較高的提取物，經離體實驗得到與動物實驗類似的結果，證實黃酮及芬酸是木賊抗AS的有效部位之一。

LOX-1是ox-LDL特異性受體，主要存在于內皮細胞膜表面，在介導內皮細胞對ox-LDL結合、內吞、降解，及內皮細胞凋亡和功能障礙等過程中起關鍵作用〔3〕。LOX-1在ox-LDL誘導內皮細胞凋亡中表達上調并介導內皮細胞凋亡，抗LOX-1抗體則抑制內皮細胞的凋亡〔9〕。本實驗表明木賊有效部位可能是通過下調LOX-1 mRNA的表達實現抑制內皮細胞凋亡的。NOX是一種過氧化物酶，其催化產物活性氧參與機體防御和信號傳導等許多生理過程。內皮細胞主要表達NOX4。NOX在內皮細胞凋亡中起了重要作用，它可能通過調節細胞內活性氧的產生而參與細胞凋亡〔9,10〕。研究表明〔11〕ox-LDL與LOX-1結合后，可激活細胞膜上的NOX，導致活性氧表達增加。抑制LOX-1能顯著降低內皮細胞中活性氧的生成及凋亡的發生〔9〕。本實驗顯示木賊有效部位可下調ox-LDL誘導的內皮細胞LOX-1 mRNA的表達，推測木賊有效部位應使NOX4 mRNA的表達下降，本實驗結果也證實加入木賊有效部位后NOX4 mRNA表達受到明顯抑制，表明NOX4 mRNA表達的下降是受LOX-1介導的，這顯示木賊有效部位抗內皮細胞凋亡與抑制LOX-1-NOX4途徑密切相關。

Chen等〔12〕報道ox-LDL通過LOX-1下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，激活Caspase-3誘導內皮細胞凋亡。最近有研究〔13〕發現ox-LDL誘導內皮細胞凋亡的可能途徑為：LOX-1通過激活NOX使活性氧產生增加，后者使p38MAPK磷酸化并激活核轉錄因子NF-κB，而NF-κB可調控Caspase-3及 Bcl-2基因的表達促進內皮細胞的凋亡。Caspase家族是多種途徑發生凋亡的關鍵酶，而Caspase-3是凋亡發生的中心環節，本研究中ox-LDL誘導的內皮細胞Caspase-3 mRNA表達升高，木賊有效部位能減少Caspase-3 mRNA表達。研究曾證實木賊有效部位可使ox-LDL誘導的血管內皮細胞Bcl-2 mRNA表達升高，Bax/Bcl-2比值明顯降低〔6〕。故推測木賊有效部位可能是通過抑制LOX-1及NOX4來達到調控凋亡相關基因表達的。

綜上所述，木賊有效部位抑制內皮細胞凋亡途徑之一可能是通過下調LOX-1表達來抑制NOX4激活，進而通過調控Caspase-3 mRNA表達減少內皮細胞的凋亡。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：甄艷君(1952-)，女，教授，碩士生導師，主要從事中藥防治動脈粥樣硬化的基礎研究。

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2343-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.013

1保定市徐水區人民醫院皮膚科2邢臺市人民醫院檢驗二科

3河北醫科大學基礎課教學部

第一作者：李志永(1974-)，男，主治醫師，碩士，主要從事中藥防治動脈粥樣硬化的基礎研究。