姜黃素對AD小鼠海馬神經元凋亡和GSK-3β表達及磷酸化的影響

冀書娟　康　康　李　浩

河南信陽市中心醫院神經內科　信陽　464000

姜黃素對AD小鼠海馬神經元凋亡和GSK-3β表達及磷酸化的影響

冀書娟康康李浩

河南信陽市中心醫院神經內科信陽464000

【摘要】目的觀察姜黃素對AD小鼠模型海馬神經元凋亡和糖原合成酶激酶3β表達及其磷酸化影響。方法將20只APP/PS1轉基因小鼠隨機分為AD模型組、AD模型+姜黃素組，每組10只，AD模型+姜黃素組腹腔注射劑量為400 mg/(kg·d)姜黃素，1次/d，連續14 d。取12只正常小鼠作對照組。采用掃描電鏡檢測小鼠海馬神經元凋亡，Western blot 檢測GSK-3β、酪氨酸磷酸化GSK-3β(pTyr-GSK-3β)和絲氨酸磷酸化GSK-3β(pSer-GSK-3β)的表達情況。結果與對照組相比，模型組海馬神經元出現染色質邊集、線粒體腫脹、細胞器減少；pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β的表達明顯增加(t=5.112，P=0.005；t=5.619，P=0.006)。與模型組相比，姜黃素組海馬神經元染色質呈彌散分布、線粒體嵴清晰可見、細胞器排列緊密，pTyr-GSK-3β表達明顯降低(t=-7.985，P=0.001)，pSer-GSK-3β表達明顯提高(t=9.105，P=0.001)。結論GSK-3β可能參與AD小鼠海馬神經元損傷，姜黃素通過減少pTyr-GSK-3β、增加pSer-GSK-3β的表達抑制GSK-3β活性來減少AD小鼠海馬神經元凋亡。

【關鍵詞】姜黃素；AD；海馬神經元；糖原合成酶激酶-3β

阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)即老年癡呆，是一種慢性退行性神經疾病，以記憶減退和認知功能障礙為臨床特征[1]。目前，臨床上缺乏有效的治療AD的藥物，且不良反應較強，因此研發不良反應小的AD治療藥成為研究的熱點[2-3]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，研究表明，GSK-3β可能與AD密切相關[4]。但姜黃素對AD引起的海馬神經元損傷具有保護作用是否與GSK-3β相關，目前尚不清楚[2，5-6]。本實驗初步探討姜黃素對AD小鼠海馬神經元凋亡和GSK-3β表達及其pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β蛋白表達的影響，為AD治療提供新的靶點。

1材料與方法

1.1實驗動物8月齡APP/PS1轉基因小鼠20只及同齡正常小鼠10只，由天津醫科大學動物中心提供，雌雄各半，體質量(20±2)g，適應性喂養1個月。

1.2主要試劑及儀器姜黃素、鼠抗人GSK-3β一抗、兔抗人pTy-GSK-3β一抗、兔抗人pSer-GSK-3β一抗、DAB顯色試劑盒購自天津化學試劑公司。掃描電鏡、電泳儀、光密度掃描儀購自美國。

1.3動物分組及處理將20只APP/PS1轉基因小鼠隨機分為2組，即AD模型組、AD模型+姜黃素組，AD模型+姜黃素組腹腔注射姜黃素，濃度為400 mg/(kg·d)，1次/d，連續14 d。同時選取10同齡正常小鼠做為對照組。

1.4檢測指標及方法

1.4.1細胞凋亡檢測：應用掃描電鏡檢測神經元凋亡，操作步驟取材、固定→切片(40 μm)→餓酸固定→脫水→樹脂包埋→超薄切片→電鏡觀察。

1.4.2Western blot檢測GSK-3β、pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β表達檢測蛋白表達：-80 ℃取出腦組織，取50mg，提取總蛋白，蛋白含量測定，電泳→轉模→封閉→一抗→孵育洗滌→二抗→顯色→熒光系統掃描→分析。

1.5統計學處理應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗，計數資料以率(%)表示，采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組海馬神經元凋亡情況比較與對照組相比，模型組海馬神經元染色質出現邊集，線粒體腫脹、嵴減少、出現空泡；與模型組相比，姜黃素組海馬神經元核膜較清晰，粗面內質網增多，線粒體嵴較清晰。見圖1。

圖1　3組掃描電鏡情況比較

2.2各組GSK-3β、pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β蛋白表達的比較與對照組相比，模型組GSK-3β總量差異無統計學意義(t=0.975，P=0.412)，pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β表達水平均明顯升高(t=5.112，P=0.005；t=5.619，P=0.006)；與模型組相比，姜黃素組GSK-3β表達水平差異亦無統計學意義(t=1.37，P=0.19)；姜黃素組pTyr-GSK-3β表達水平明顯降低(t=-2.994，P=0.017)，pSer-GSK-3β表達水平明顯升高(t=4.009，P=0.017)。見表1、圖2。

表1　各組GSK-3β、pTyr-GSK-3β、pSer-GSK-3β

注：與對照組比較，?P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

圖2　各組GSK-3β、pTyr-GSK-3β、PSer-GSK-3β蛋白表達

3討論

姜黃素是中藥姜黃中的有效成分，現已證實其具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，其對AD的保護作用近年來備受青睞[7-8]。本次實驗發現，AD小鼠模型的海馬神經元細胞凋亡現象明顯。我們給予AD小鼠400 mg/(kg.d)姜黃素，雖然未能完全消除AD引起的細胞凋亡，但其凋亡情況明顯好于模型組，與模型組比較，核膜、線粒體嵴較清晰，這一現象表明，姜黃素可能減少海馬神經元的凋亡。

GSK-3β是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，具有廣泛的生理作用，參與細胞增值、凋亡等過程，分子量為47Kd。GSK-3β具有雙向調節的特性，第216位上的酪氨酸磷酸化使其活性增強，反之減弱；第9位上的絲氨酸磷酸化使其失活，反之增強[9-11]。GSK-3β的活性受到抑制或者失活，會抑制線粒體通透性轉換孔(mPTP)開放[11-13]，阻止細胞色素C釋放到胞漿中，從而阻止casPase級聯反應，進而抑制細胞凋亡[14-15]。本次實驗發現，AD上調PTyr-G S K-3β和PSer-GSK-3β的表達，提示GSK-3β磷酸化參與海馬神經元的AD損傷。姜黃素組的GSK-3β表達水平無明顯變化，但可上調PSer-GSK-3β和下調PTyr-GSK-3β的表達，提示姜黃素通過上調PS er-GSK-3β和下調PTyr-GSK-3β的表達而抑制GSK-3β的活性，從而減少AD海馬神經元凋亡，減輕、延緩AD進程。

4參考文獻

[1]黃漢昌，姜瑞瑞，林婧，等.阿爾茨海默病發生機制及其治療藥物研究進展[J].中國老年學雜志，2011，31(15)：2 995-2 997.

[2]孟凡超，王運良，尹紅蕾，等.姜黃素對Aβ誘導的老年癡呆大鼠海馬膠質纖維酸蛋白表達的影響[J].中國老年學雜志，2012，32(10)：2 119-2 121.

[3]王琦，劉瑜琦.姜黃素對阿爾茨海默病發病機制作用的研究進展[J].中國老年學雜志，2014，34(10)：2 911-2 914.

[4]Lehmann SW，Lee J.Lithium-associated hyPercalcemia andhyPerParathyroidism in the elderly：what do we know[J].J Affect Disord，2013，146(2)：151-157.

[5]Dominguez JM，Fuertes A，Orozco L，et al.Evidence for irreversible inhibition of glycogen synthase kinase-3beta by tideglusib[J].J Biol Chem，2012，287(2)：893-904.

[6]Tang H，Shen N，Jin H et al.GSK-3beta PolymorPhism discriminates biPolar disorder and schizoPhrenia：a systematic meta-analysis[J].Mol Neurobiol， 2013，48(3)：404-411.

[7]劉星，耿杰峰，卜憲章，等.姜黃素及其衍生物對Aβ42引起神經元損傷的保護作用[J].中國老年學雜志，2011，31(13)：2 522-2 524.

[8]張慧，姜詠梅，尹琳.PI3K/A K T/GSK-3β 信號在腦缺血預處理中的作用及對海馬細胞凋亡的影響[J].華中科技大學學報(醫學版)，2011，40(4)：408-413.

[9]Hurtado DE， Molina-Porcel L，Carroll JC，et al.Selectively silencing GSK-3 isoforms reduces Plaques and tangles in mouse models of Alzheimer’s disease[J]. J Neurosci，2012，32(21)：7 392-7 402.

[10]Freland L，Beaulieu JM.Inhibition of GSK3 by lithium from single molecules to signaling networks[J].Front Mol Neurosci，2012，27(5)：14-21.

[11]Zhang X，Heng X， Li T，et al.Long-term treatment with lithium alleviates memory deficits and reduces amyloid-beta Production in an aged Alzheimer’s disease transgenic mouse model[J].J Alzheimers Dis，2011，24(4)：739-749.

[12]Marin-Burgin A，Schinder AF.Requirement of adult-born neurons for hiPPocamPus-dePendent learning[J].Behav Brain Res，2012，227(2)：391-399.

[13]Hendrie HC，Tu W，Tabbey R，et al.Health outcomes and cost of care among older adults with schizoPhrenia：a 10-year study using medical records across the continuum of care[J].Am J Geriatr Psychiatry，2014，22(5)：427-436.

[14]LiPina TV，Palomo V，Gil C，et al.Dual inhibitor of PDE7 and GSK-3-VP1.15 acts as antiPsychotic and cognitive enhancer in C57BL/6J mice[J]. NeuroPharmacology，2013，64(3)：205-214.

[15]Beaulieu JM.A role for Akt and glycogen synthase kinase-3 as integrators of doPamine and serotonin neurotransmission inmental health[J].J Psychiatry Neurosci，2012，37(1)：7-16.

(收稿2015-04-27)

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)09-0037-02