神經導向因子Netrin-1對血管內皮細胞生長因子蛋白表達的影響

李敬華　王素莉　沈繼春

武警后勤學院附屬醫院內分泌科　天津　300162

神經導向因子Netrin-1對血管內皮細胞生長因子蛋白表達的影響

李敬華王素莉沈繼春

武警后勤學院附屬醫院內分泌科天津300162

【摘要】目的研究神經導向因子Netrin-1與血管內皮細胞生長因子蛋白表達之間的關系。方法選取無特定病原體(SPF)級Wistar大鼠，從其骨髓腔中分離獲得間充質干細胞(MSCs)后37 ℃、5% CO2培養至傳代4次。采用Transwell法進行細胞遷移實驗，分為空白組、VEGF組、Netrin-1組及Netrin-1加VEGF組，培養12 h后顯微鏡觀察并計算每孔細胞數目，培養1周后測定管腔周長、管腔數目及分支點數目。將轉染Netrin-1重組子后的MSCs細胞懸液、未轉染的MSCs細胞懸液接種于大鼠腹部皮下，以Matrigel膠作為空白對照組，移植10 d、20 d、30 d后取出膠栓，免疫組化法檢測VEGF表達水平。結果在細胞遷移及小管形成實驗中，VEGF組與Netrin-1組細胞遷移數量、小管形成中的管腔周長、管腔數目及分支點數目無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)；而VEGF加Netrin-1組與VEGF組或Netrin-1組比較，細胞遷移數升高，管腔周長變長，管腔數目和分支點數目均明顯增多，差異具有統計學意義(P<0.01)。體內血管生成實驗中，移植轉染Netrin-1重組子的MSCs與移植普通MSCs相比，MSCs/Netrin-1組的VEGF蛋白水平更高，差異具有統計學意義(P<0.01)。結論Netrin-1和VEGF促進血管生成的能力相當，兩者結合更能促進血管生成。神經導向因子Netrin-1促進血管內皮細胞生長因子蛋白表達。

【關鍵詞】Netrin-1；血管內皮細胞生長因子；血管生成

Netrin-1是細胞分泌型可溶性蛋白，具有神經細胞軸突導向和細胞遷移誘導作用，由于機體內神經和血管相互伴行，所以Netrin-1不但可以調節神經系統的發育，還參與血管系統的發育[1]。Netrin-1在脈管系統形成發育的初期，可以促進不同內皮細胞的有絲分裂、黏附以及細胞遷移，是一種血管生成調節因子[2-3]。血管生成與新生與促血管生成因子密切相關，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板源性生長因子(PDGF)等[4]。VEGF通過與特異性受體(如VEGF-1、VEGF-2、neuropilin-1、neuropilin-2等)結合激活一系列細胞信號通路，促進血管內皮細胞有絲分裂及血管形成[5]。近年研究證實，Netrin-1與VEGF的功能相關[6-7]。但Netrin-1與VEGF蛋白表達之間的關系仍少有報道。本研究通過轉染Netrin-1基因重組子入間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)并表達出Netrin-1蛋白，移植轉染Netrin-1基因重組子的MSCs與轉染空載體的MSCs到大鼠皮下組織，移植10、20、30 d后檢測Netrin-1與VEGF蛋白表達及微血管形成數量情況，分析Netrin-1與VEGF蛋白表達之間的關系。

1材料與方法

1.1研究對象、主要試劑和儀器4周齡的健康雄性Wistar大鼠，體質量150～200 g，清潔級。

主要試劑：Netrin-1蛋白、VEGF蛋白：美國BM。Trypsin-EDTA、細胞培養皿、細胞培養板、巴斯德管：美國Gibco。MesenCult培養基、DMEM培養基、淋巴細胞分離液：加拿大StemCellTechnllogies。兔抗鼠Netrin-1抗體、羊抗兔二抗、大鼠Netrin-1酶聯免疫試劑盒：USCN公司。

主要實驗設備和儀器：手術器械、細胞計數板：上海醫療器械公司。流式細胞儀：德國BD公司生產。CO2培養箱3336型：美國SHEL公司。低溫高速離心機：德國EPPENDORF。超低溫冰箱：美國Forma Scientific公司。

1.2研究方法

1.2.1MSCs細胞的分離和培養：SPF(Specific Pathogen Free，無特定病原體)級Wistar大鼠頸椎脫臼處死后，無菌條件下分離股骨、腓骨，75%酒精消毒后去除肌肉組織，剪除干骺端，用PBS沖洗骨髓腔，制成細胞懸液。加Percoll淋巴細胞分離液離心處理獲得單個核細胞。用15%血清加DMEM培養基在37 ℃，5% CO2飽和濕度培養箱內培養至細胞貼壁，傳代4次。

1.2.2將Netrin-1基因重組質粒轉染到MSCs，并表達出Netrin-1蛋白：將4 mL MSCs傳代細胞懸液置于四孔板內，計算4 mL細胞懸液含有細胞數(約16×109個)，按每2×108個細胞需要Netrin-1基因重組子12.5 μmol及轉染液3 μL的比例加入后混合，于25 ℃恒溫培養24 h。

1.2.3Transwell細胞遷移試驗：將Transwell小室置于24孔培養板中，小室上層加入MSC培養基，37 ℃下平衡1 h。0.35%胰蛋白酶結合0.02% EDTA分離MSCs，用無血清DMEM培養基重懸細胞至濃度為每mL 1×l05個。取100 μL(1×l04)加入Transwell小室的上室，下室內不加或加入Netrin-1(50 ng/mL)和(或)VEGF(10 ng/mL)的MSC培養液600 μL，分別為空白(陰性)對照組、Netrin-1組、VEGF(陽性)組及Netrin-1加VEGF組，每組6個復孔，共4組于培養箱中培養12～18 h。后用吸管吸出培養基，PBS溶液洗滌小室3～5次后取出小室濾膜，用3.5%甲醛固定5～10 min，1.5%結晶紫染色5～10 min后，干燥濾膜。100～200倍光鏡下觀察濾膜細胞，每個小室隨機選擇4～5個視野，計數每個視野的細胞數目，取平均值。細胞數目的多少反映其遷移能力的高低。

1.2.4小管形成：未轉染的MSCs在MesenCult Medium培養，分為4組即空白對照組(陰性對照)，VEGF組(10 ng/mL VEGF，陽性對照)，Netrin-1組(50 ng/mL Netrin-1)，Netrin-1加VEGF組培養。1周后測定管腔周長、管腔數目及分支點數目。

1.2.5體內血管生成：將轉染后的MSCs細胞懸液(2×106個細胞)接種于大鼠腹部皮下并用苦味酸標記。實驗動物分為3組：空白對照組(Matrigel膠)、MSCs組(Matrigel膠+未轉染的MSCs)、MSCs/Netrin-1組(Matrigel膠+轉染Netrin-1重組子的MSCs)，每組6只大鼠。移植10、20、30 d后，取出膠栓固定染色，檢測VEGF表達水平。

1.2.6ELISA法檢測MSCs細胞懸液中Netrin-1蛋白：適當稀釋Netrin-1蛋白標樣后，將酶標液加入平板孔中，另設空白對照組(不加抗原物質)，每孔90 μL，4 ℃儲存12 h。每孔分別加100 μL 1.5% PBS/T20-BSA、100 μL抗血清、100 μL兔抗鼠Netrin-1抗體、100 μL HRP的底物緩沖液，每加一種物質前先用PBS洗版2次，5 min/次，加入后于37 ℃培養1～2 h。最后用60 μL 20%的H2SO4終止反應后，從酶聯免疫檢測儀上讀取OD值。

1.2.7免疫組化法檢測：VEGE蛋白水平：將Matrigel膠板從大鼠體內取出后，浸泡于15%福爾馬林液35 ℃固定處理1 h后取出，利用酒精濃度梯度脫水、脫蠟、制片；微波修復后，加入非免疫性動物血清，35 ℃培養15 min；吸管吸棄血清后加入一抗、鏈霉菌抗生素-過氧化酶溶液，35 ℃培養15 min；采用二氨基聯苯胺溶液、蘇木素、DAB溶液分別進行組織膠板顯色、復染、再顯色5～10 min，顯微鏡下觀察，陽性顯色為棕黃色；BX51成像系統下成像，VEGF蛋白光密度值(IOD)采用Image Pro-Plus 5.1軟件處理。

1.3統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件處理數據，計數資料以率(%)表示，采用2檢驗，計量資料以±s表示，采用t檢驗，體外Transwell細胞遷移實驗、小管形成實驗、體內血管生成實驗中，組間或組內比較采用方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1轉染后MSCs中Netrin-1表達水平將Netrin-1基因重組到質粒上轉染到MSCs中，在一定時間段內，隨著時間延長，Netrin-1分泌逐漸增多，在第4天時達最高，以后Netrin-1分泌量又逐漸降低。見圖1。

2.2細胞遷移與空白組比較，VEGF組、Netrin-1組以及Netrin-1+VEGF組細胞遷移數量均有明顯的增多，差異具有統計學意義(P<0.05)。Netrin-1+VEGF組與VEGF組或Netrin-1組比較，細胞遷移數升高，差異有統計學意義(P<0.05)；Netrin-1組與VEGF組比較，細胞遷移數變化不大，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1　MSCs中Netrin-1蛋白的分泌

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與VEGF組比較，P<0.01；與Netrin-1組比較，△P<0.01

圖2體外MSCs遷移數量

2.3體外小管形成與VEGF組比較，Netrin-1組的管腔周長、管腔數目以及分支點無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)，Netrin-1+VEGF組的管腔周長、管腔數目以及分支點明顯增多，差異有統計學意義(P<0.01)。與Netrin-1組比較，Netrin-1+VEGF組的管腔周長、管腔數目以及分支點也明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　MSCs小管形成水平評價

注：與VEGF組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Netrin-1組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.4體內血管生成與空白組比較，移植后第10天、20天MSCs組和MSCs/Netrin-1組的VEGF蛋白水平較高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與MSCs組比較，MSCs/Netrin-1組的VEGF蛋白水平更高，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2　VEGF蛋白表達水平

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與MSCs組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3討論

與神經元的生長方式類似，生長中的血管叢最前方的端細胞通過伸出的絲狀偽足探測細胞外基質中的VEGF，芽生的毛細血管順VEGF濃度梯度生長，相鄰內皮的端細胞融合形成管腔，產生新的血管分支[8]。大量研究表明，MSCs能保持干細胞部分特性，在體外具有分化成為血管壁結構成分的能力，體內能促進缺血血管新生[9-11]。因此，將MSCs進行基因修飾或聯合細胞因子移植(如Netrin-1)對治療缺血性疾病有重要意義。

本文結果顯示，VEGF組與Netrin-1組的體外細胞遷移數量相差不大，而Netrin-1+VEGF組分別與VEGF組與Netrin-1組比較，細胞遷移數量明顯上升(P<0.01)。其原因可能是：Netrin-1與VEGF協同作用，促進MSCs的遷移。Netrin-1與位于MSCs細胞膜上的UNC5C(Netrin-1的受體)結合，信號傳導至細胞內，促進上皮細胞的增殖并向損傷處移動[12]。另有研究[13]表明，機體黏膜在缺氧時，缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)通過誘導Netrin-1基因表達，促進中性粒細胞以及內皮細胞的遷移，及時修復機體受損的皮膚黏膜。體外小管形成實驗結果顯示，VEGF組與Netrin-1組比較，管腔周長、管腔數目以及分支點無明顯變化(P>0.05)；Netrin-1+VEGF組與VEGF組或Netrin-1組比較，管腔周長、管腔數目以及分支點明顯增多(P<0.01)。其原因可能為：Netrin-1與VEGF協同作用，促進小管形成，其機制與細胞遷移相似。Netrin-1+VEGF組的MSCs遷移能力以及小管形成能力明顯增加，因此，在動物體內可以誘導移植的MSCs進入缺血區域，加速局部小管的形成，促進缺血區的血管形成，從而改善缺血癥狀[14]。

體內血管生成實驗結果顯示，移植轉染Netrin-1重組子的MSCs與移植普通MSCs相比，VEGF蛋白表達水平具有顯著變化。與MSCs組比較，MSCs/Netrin-1組的VEGF蛋白水平更高(P<0.01)。其原因可能為：一方面，Matrigel膠占據組織細胞周圍的氧氣空間，使MSCs處于低氧狀態，刺激MSCs表達HIF-1α，HIF-1α刺激周圍細胞分泌VEGF，從而導致VEGF水平升高，誘導MSCs分化加速血管形成；另一方面，Netrin-1不但能與MSCs上的受體結合促進血管生成，還能促進VEGF表達水平[15]。

綜上所述，VEGF和Netrin-1對血管生成均有促進作用，且Netrin-1能夠促進VEGF的表達，為利用MSCs進行基因修飾或聯合細胞因子移植(如Netrin-1)治療缺血性疾病如糖尿病引起的下肢缺血性疾病提供實驗依據。

4參考文獻

[1]柯先金，李倩，丁新生.神經導向因子Netrin-1及其受體的作用研究現狀[J].神經損傷與功能重建，2011，6(2)：142-146.

[2]Masuda T，Watanabe K， Sakuma C，et al. Netrin-1 acts as a repulsive guidance cue for sensory axonal projections toward the spinal cord[J] .J Neurosci， 2008， 28(41)：10 380-10 385.

[3]Rodrigues S， De Wever O，Bruyneel E， et al.Opposing roles of netrin-1 and the dependence receptor DCC in cancer cell invasion， tumor growth and metastasis[J].Oncogene，2007， 26(38)：5 615-5 625.

[4]Kajdaniuk D， Marek B， Foltyn W， et al.Vascular endothelial growth factor (VEGF)-part 1 ：in physiology and pathophysiology[J]. Endokrynologia Polska， 2011， 62(5)： 444-455.

[5]沈頡.血管內皮生長因子在血管外膜成纖維細胞的表達研究[J].當代醫學，2012，18(24)：24-26.

[6]Lee HK， Seo IA， Seo E， et al.Netrin-1 induces proliferation of Schwann cells through Unc5b receptor[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，362(4)： 1 057-1 062.

[7]何章彪，曹翠萍，劉衛華，等.Netrin-1及VEGF在食管鱗癌組織中的表達水平及其相關性研究[J].重慶醫學，2013，17(6)：34-39.

[8]Takahashi S.Vascular endothelial growth factor (VEGF)，VEGF receptors and their inhibitors for antiangiogenic tumor therapy[J].Biological Pharmaceutical Bulletin，2011，34(12)： 1 785-1 788.

[9]Al-Khaldi A，Al-Sabti H， Galipeau J.Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells： improved blood flow in a chronic limb ischemia model[J]. Ann Thorac Surg， 2003，75(6)： 204-209.

[10]辛毅，李娜，黃益民，等.小鼠骨髓間充質干細胞定向誘導分化血管內皮細胞的實驗研究[J].新鄉醫學院學報，2014，1(8)：114-119.

[11]黃鳳.經穴注射BMSCs聯合益氣活血方對DM后肢缺血大鼠血管再生作用機制研究[D].北京：北京中醫藥大學，2014.

[12]Sebastien K， Celine G， Fabrice A，et al. Evaluation of the colorectal cancer risk conferred by rare UNC5C alleles[J]. World J Gastroenterol，2014，20(1)： 236-239.

[13]Rosenberger P， Schwab JM， Mirakaj V ，et al.Hypoxia-inducible factor-dependent induction of netrin-1 dampens inflammation caused by hypoxia[J].Nat Immunol，2009，10(2)：195-202.

[14]李倩.神經導向因子Netrin-1對間充質干細胞血管形成能力的作用研究[D].江蘇南京：南京醫科大學，2009.

[15]柯先金，李倩，朱劍，等.神經導向因子Netldn-1促進骨髓間充質干細胞的血管生成作用[J].中華內分泌代謝雜志，2012，28(9)：750-753.

(收稿2015-04-02)

Positive impact of Netrin-1 on the expression of VEGF protein

LiJinghua，WangSuli，ShenJichun

DepartmentofEndocrinology，AffiliatedHospitaloftheArmedPoliceLogisticsCollege，Tianjin300162，China

【Abstract】Objective To study the relation between Netrin-1 (nerve guidance factor) and VEGF (vascular endothelial growth factor) protein. Methods SPF (specific pathogen free) Wistar rats were selected as objects， mesenchymal stem cells (MSCs) were acquired from rats' bone marrow cavity and were cultured under the situation of 37 ℃ and 5% CO2 until 4 generations. According to Transwell method， we used cell migration assays to divided rats into 4 groups： control group， VEGF group， Netrin-1 group and VEGF+Netrin-1 group. Then the number of cells per hole were calculated and observed by microscopy after 12h culture. In addition， the perimeter， the number of lumens and the number of branch points were measured after one-week culture. MSCs cells suspension transfected by Netrin-1 recombinant plasmid and non-transfected MSCs cells suspension were inoculated at rats' abdominal subcutaneous tissues. At the same time， we regarded Matrigel glue as blank control group， then pulled the glue emboli out after 10-， 20-， 30-day transplantation to test the expression level of VEGF. Results In cell migration and tube formation assays， cell migration number， the lumen perimeter， cavity number and branch number of the formed tube showed no significant differences between VEGF group and Netrin-1 group (P>0.05)； Additionally， compared with VEGF group or Netrin-1 group， the number of cell migration， cavity and branch points were increased and the lumen perimeter was elongated in VEGF+Netrin-1 group with obviously statistical differences (P<0.01). In vivo angiogenesis assay， compared with non-transfected MSCs suspension group， MSCs/Netrin-1 group transfected by Netrin-1 recombinant had higher expression level of VEGF protein with statistically significant difference (P<0.01). Conclusion Both Netrin-1 and VEGF are capable of promoting angiogenesis， and their combination can have better effect. Netrin-1 promotes the expression of VEGF protein.

【Key words】Netrin-1； Vascular endothelial growth factor； Angiogenesis

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)09-0003-04