雙波長HPLC法同時測定玄麥甘桔顆粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

舒柯

【摘要】目的：建立以雙波長HPLC法同時測定玄麥甘桔顆粒中哈巴苷、哈巴俄苷含量的方法。方法：色譜柱Dikmaonsil C18（250mm×46mm，5μm）；以乙腈（A）-01%磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫：0～18min，5%A；18～25min，5%～29%A；25～55min，29%A；55～56min，90%A；56～60min，5%A；檢測波長為210nm（哈巴苷）和 278 nm（哈巴俄苷），體積流速1ml/min；柱溫：30℃。結(jié)果：哈巴苷、哈巴俄苷的進(jìn)樣量線性范圍分別為003931μg～04914μg、0005835μg～004862μg，回歸方程分別為Y=20511X+10747，r=09997、Y=12246X+0596，r=09997；二者的平均加樣回收率分別為960%、1022%，RSD分別為13%、12%（n=6）。結(jié)論：所建立的雙波長法能方便、快速地對中藥中多種成分同時測定，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】玄麥甘桔顆粒；哈巴苷；哈巴俄苷；雙波長高效液相色譜法；含量測定；質(zhì)量控制

【中圖分類號】R2860【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）10-0031-03

Abstract：Objective To establish a method for Simultaneous Determination of the content of harpagide and harpagoside in Xuanmai Ganjie grains. Method The analysis was carried on a column of C18（Dikmaonsil C18，250mm×46mm，5μm）at 30℃；acetonitrile（A）-01%Phosphoric Acid（B） by gradient elution （0～18min，5%A；18～25min，5%～29%A；25～55min，29%A；55～56min，90%A；56～60min，5%A） as mobile phase；the flow rate was 10ml/min；The detection wavelength was set at 210 nm for harpagide，and at 278 nm for harpagoside . Results The linear ranges of harpagide and harpagoside were 003931μg～04914μg（r=09997）、0005835μg～004862μg（r=09997），the regression equation as Y=20511X+10747， r=09997、Y=12246X+0596，r=09997. Average recoveries of them were 960%，1022%，RSD were 13%，12%，respectively（n=6）.Concluslon Dual wavelength HPLC method can be used for simultaneous determination of ingredients of traditional Chinese medicine，and can satisfy the requirements of quality control.

Keywords：Xuanmai Ganjie grains； harpagide； harpagoside； Dual-wavelength HPLC； Content determination； Quality control

玄麥甘桔顆粒由玄參、麥冬、甘草、桔梗四味藥材組成，具有清熱滋陰，祛痰利咽的功效，用于陰虛火旺，虛火上浮，口鼻干燥，咽喉腫痛。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中除TLC鑒別外，只有甘草中甘草酸和玄參中哈巴俄苷的含量測定項目，對于中藥制劑的質(zhì)量控制尚不全面。方中玄參具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)的功效，玄參中主要的活性化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜類和苯丙苷素類，其中哈巴苷和哈巴俄苷為主要的環(huán)烯醚萜苷類成分，且采用雙波長HPLC同時測定玄麥甘桔顆中哈巴苷、哈巴俄苷的含量的方法未見報道。研究根據(jù)相近產(chǎn)品檢測方法的文獻(xiàn)報道[1-2]，采用雙波長高效液相色譜同時檢測哈巴苷和哈巴俄苷的含量，可更有效的控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1儀器與材料

11儀器Ultimate 3000高效液相色譜儀（DAD檢測器）；METTLER TOLEDO AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DA型數(shù)控超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

12材料哈巴苷（批號：111729-201204）、哈巴俄苷（批號：111730-201106）對照品由中國藥品生物制品檢定院提供。玄麥甘桔顆粒（批號：ZCA1413，云南白藥股份有限公司）。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

21 色譜條件色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以01%磷酸為流動相B；按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為210nm、278nm；柱溫：30℃；流速：10ml/min，進(jìn)樣量：20μl。

22對照品溶液的制備取哈巴苷、哈巴俄苷對照品適量，精密稱定，加30%甲醇制成每1ml含哈巴苷25μg、哈巴俄苷20μg的混合溶液，即得。

23供試品溶液的制備取裝量差異下的本品，混勻，取適量，研細(xì)，取約2g，精密稱定，置具塞錐瓶中，精密加入80%甲醇25ml，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率35kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

24線性關(guān)系考察精密吸取哈巴苷對照品溶液（19656μg/ml）2、4、7、10、25μl，吸取哈巴俄苷對照品溶液（1945μg/ml）3、5、10、20、25 μl，依次注入液相色譜儀測定峰面積。計算回歸方程：哈巴苷對照品Y=20511X+10747，r=09997；哈巴俄苷對照品Y=12246X+0596，r=09997，表明哈巴苷、哈巴俄苷分別在3931～4914ng、5835～4862ng范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

25精密度試驗取“22”項下的哈巴苷、哈巴俄苷對照品溶液，在“21”項的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算哈巴苷、哈巴俄苷的RSD分別為18%、03%。

26重復(fù)性試驗取同一批樣品，按“23”項下方法制備6份供試品溶液，在“21”項下進(jìn)行峰面積測定，得到哈巴苷、哈巴俄苷的RSD均為12%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

27穩(wěn)定性試驗取同一樣品，按“23”項下方法制備1份供試品溶液，溶液分別放置2、4、8、12、18h后各進(jìn)樣20μl，測定哈巴苷、哈巴俄苷的峰面積，其RSD分別為18%、10%。

28加樣回收率試驗取已測定含量的玄麥甘桔顆粒1g，精密稱定，置于三角燒瓶中，精密加入哈巴苷、哈巴俄苷對照品混合溶液（7416ng/ml、05580ng/ml）25ml，按“23”項下方法制備供試品溶液，計算回收率，結(jié)果哈巴苷平均回收率為960%，RSD為13%；哈巴俄苷平均回收率為1022%，RSD為12%。結(jié)果見表1。

29樣品含量測定分別取玄麥甘桔顆粒樣品6份，按“23”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，以外標(biāo)法計算樣品中哈巴苷和哈巴俄苷的含量。結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷的含量分別為01256mg/g、00472mg/g。對照品、供試品色譜見圖1。

3討論

在供試品溶液制備中，分別對超聲提取和回流提取進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示回流提取和超聲提取沒有顯著性差異，故選用超聲提取。對超聲提取時間15～60min進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示提取30min后，樣品中哈巴苷、哈巴俄苷基本提取完全，故采用超聲提取30min。流動相選擇上曾選用不同比例的乙腈-甲酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液為流動相，但基線不穩(wěn)定，哈巴苷、哈巴俄苷與相鄰色譜峰不能完全分離且峰形不對稱。參照中國藥典[3]及文獻(xiàn)[4]的方法，采用乙腈-01%磷酸溶液梯度洗脫，方得滿意結(jié)果。

試驗中，將哈巴苷、哈巴俄苷對照品混合溶液，在DAD進(jìn)行全波長紫外掃描。結(jié)果，哈巴苷在210nm處，哈巴俄苷在278nm處吸收值最大，并在此處無干擾，故選擇雙波長，在210nm測定哈巴苷，在278nm測定哈巴俄苷。

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，有效成分往往難以明確，其質(zhì)量控制是一項系統(tǒng)復(fù)雜的工程。提高中藥質(zhì)量控制的水平，增加質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對于保證產(chǎn)品的質(zhì)量，保證制劑的穩(wěn)定性、安全性和有效性，有著重要意義。控制中藥復(fù)方制劑最有效的手段是采用多種成分同時進(jìn)行定量測定。玄麥甘桔顆粒相關(guān)的研究文獻(xiàn)多限于選擇單獨測定哈巴苷或者哈巴俄苷含量，本研究采用的雙波長高效液相色譜法，同時測定玄麥甘桔顆粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量，該方法靈敏度、精密度均能達(dá)到檢測要求，進(jìn)一步為企業(yè)提供了質(zhì)量控制，同時作為一種質(zhì)控手段從操作簡便性上具有一定的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 李振東，徐位良，羅嬌艷. HPLC法測定玄麥甘桔顆粒中哈巴俄苷與肉桂酸含量[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報，2008，24（2）：130-132.

[2] 蔣華科，陳純，符孝軍.高效液相色譜法測定玄麥甘桔顆粒中甘草酸的含量[J].中南藥學(xué)，2012，10（2）：103-105.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：102.

[4] 楊輝.雙波長UPLC法同時測定艾滋病口腔含簌液中梓醇、哈巴苷和哈巴俄苷的含量[J].天中國藥房，2015，26（24）：3414-3415.

（收稿日期：20160324）