草魚（♀）×赤眼鱒（♂）雜交F1與其親本的肌肉特性比較研究

李迪 李偉 肖調義　褚武英　何美鳳　周智愚　金生振　鄧亞林

摘 要 為探討草魚（♀）×赤眼鱒（♂）雜交F1的肉質特點，以同規格的草魚（♀）×赤眼鱒（♂）雜交F1和其親本草魚（母本）、赤眼鱒（父本）為材料，采用質構儀測定分析比較了三者肌肉質構特性，采用冷凍切片法和HE染色法統計分析比較了三者肌纖維數量和密度，采用實時熒光定量PCR的方法分析了與肉質特性關聯緊密的鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）基因、Ⅰ型膠原蛋白α1基因（COL1A1）和α2基因（COL1A2）.在雜交F1和親本肌肉中的表達量.結果顯示：雜交F1與母本草魚、父本赤眼鱒的肌肉黏附性、膠著性和回復性無顯著性差異（P>0.05）；雜交F1的肌肉硬度、彈性、內聚性和咀嚼性均顯著高于母本草魚（P<0.05），與父本赤眼鱒無顯著差異；雜交F1的肌纖維直徑和密度與其母本草魚無顯著差異（P>0.05），與其父本赤眼鱒差異顯著（P<0.05）；COL1A1和COL1A2兩個基因在雜交F1肌肉組織中的表達量顯著高于其母本草魚（P<0.05），而與其父本赤眼鱒無顯著差異（P>0.05）；CAST基因在雜交F1肌肉組織中的表達量顯著高于其母本草魚（P<0.05），與其父本赤眼鱒無顯著差異（P>005）.

關鍵詞 草魚（♀）×赤眼鱒（♂）雜交F1；肉質；肌纖維；I型膠原蛋白α1；I型膠原蛋白α2；鈣蛋白酶抑制蛋白

中圖分類號 S963.3 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2537（2016）03-0028-06

Abstract Objective：To explore the muscle texture of the crossbreed F1. Method： The female parent grass carp （Ctenopharyngodon idellus） （♀） × Barbel chub （Squaliobarbus curriculus） （♂） F1（crossbreedF1） as well as their parents at the same specification were used for our research. The texture analyzer， the freezing sectioning technology and hematoxylin-eosin staining method were used for muscle characterization and fiber diameter. In addition， the spatio-temporal expression of COL1A1， COL1A2， CAST genes were identified by RT-PCR. Our results show that hybrid F1 muscle fiber diameter is less than that of the female parent grass carp. By using the real-time PCR technology， we found that COL1A1， COL1A2 and CAST genes expressions in hybrid F1 muscle volume were slightly higher than the expression on grass carp muscle. Results： The muscle tenderness， cohesiveness， springiness and chewiness in crossbreed F1 is significantly better than those of grass carp （P<0.05）. No significant difference was found for barbell chub. The muscle adhesiveness， gumminess and resilience had no significant difference in hybrid F1， grass carp and barbell chub （P>0.05）. The muscle fiber diameter and density of crossbreed F1 when compared with grass carp had no significant difference （P>0.05）. But they were significantly different when compared with barbell chub （P>0.05）. The expression of COL1A1， COL1A2， CAST genes in crossbreed F1 was significantly higher than that grass carp （P<0.05）， but was no significantly different in comparison with barbell chub （P>0.05）.

Key words grass carp （♀）×barbel chub （♂） crossbreed F1； muscle texture； muscle fiber； COL1A1；COL1A2；CAST

草魚是我國養殖產量最大的淡水經濟魚類.由于生產上近親繁殖的影響，草魚種質資源衰退較為嚴重，疾病頻發，其品質也呈下降趨勢，肉質疏松、口感下降等問題嚴重影響其經濟價值.提高草魚抗病力和改善草魚肉質是目前急需解決的問題，遠緣雜交育種是實現這一目標的有效方法之一.

赤眼鱒與草魚同屬雅羅魚亞科，不僅外形上與草魚相似，還具有抗草魚出血病毒（GCRV）強的優點，本課題研究團隊在2010年完成了草魚與赤眼鱒的雜交試驗，獲得了正交F1和反交F1兩個雜交子代群體[1].基于日常生活中魚產品肉質的口感是吸引消費者的重要原因，本實驗選取正交F1為試驗對象，結合其母本草魚和父本赤眼鱒的肉質特點，對其進行了肌肉特性分析比較研究，并采用Real Time PCR技術，從mRNA水平研究COL1A1，COL1A2，CAST三個基因在不同群體的表達水平，探索基因表達與肉質性狀之間的關系，從分子水平對肌肉品質差異的形成進行初步分析，從而系統評價正交F1.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取18月齡雜交F1（體重953.09±23.63 g，體長36.24±0.31 cm）、赤眼鱒（體重235.71±9.81 g，體長20.54±0.35 cm）和草魚（體重2 215.65±69.65 g，體長47.56±0.45 cm）健康個體各10尾，所有樣品均由瀏陽烏龍漁場養殖基地提供.

1.2 樣品的采集和處理

每種魚各取10尾，取魚體側線上部的背部肌肉，在下面放有冰塊的解剖盤內按橫縱方向修好組織塊（1 cm×1 cm×0.5 cm）.采下后放于30%的蔗糖溶液中脫水24 h.采取背中部肌肉樣品用于質構實驗.另采取部分背肌放入已滅菌的1.5 mL離心管中，迅速放入液氮中帶回實驗室，置于-80 ℃冰箱保存，用于實時定量PCR分析.

1.3 實驗方法

1.3.1 肌肉質構特性的測定 采取魚背中部肌肉切成厚20 mm×15 mm×15 mm的小塊，利用TA.XT.Plus型物性測試儀（英國Stable Micro Systems公司），使用平底柱形探頭P/36，模擬人牙齒咀嚼食物，對樣品進行兩次壓縮TPA測試，測試條件如下：測試前速率5 mm/s，測試速率1 mm/s，測試后速率5 mm/s，壓縮程度60%，停留間隔時間5 s，負重探頭類型：Auto-5g，數據收集率200 pps.樣品在室溫下進行TPA測試，每尾魚取4個平行樣進行測定.

1.3.2 冷凍切片的制備 將樣品修整好后放入樣品托上，均勻抹上OCT，迅速放入冰凍切片機內.待OCT均變為白色后，用刀片休整組織塊并切片.其后再進行HE染色.切片制作完成后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照（如圖1）.

1.3.3 相關肉質基因表達 采用Trizol法提取肌肉RNA，按照Fermentas pure公司提供的cDNA試劑盒產品說明書完成cDNA第一鏈的合成.使用Primer 5.0軟件設計COL1A1，COL1A2以及CAST的定量引物（如表1），送于鉑尚公司合成.用于熒光定量表達實驗，反應程序如表2.

1.4 數據統計與分析

用Image-pro plus 6.0進行肌纖維統計，熒光定量數據用EXCEL進行整理，采用SPSS軟件對數據進行統計分析，以各組平均值和標準差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2 結果

2.1 質構特性

通過質構儀對雜交F1及其親本的測定，得到結果見表3.雜交F1和母本草魚、父本赤眼鱒的肌肉黏附性、膠著性和回復性無顯著性差異（P>0.05）；雜交F1肌肉硬度和彈性（分別為4 791.02±427.89 g和0.65±0.05），顯著高于母本草魚的肌肉硬度和彈性（分別為2 348.82±194.69 g和0.42±0.02） （P<0.05）.與其父本赤眼鱒肌肉硬度和彈性（分別為4 658.51±564.32 g和0.64±0.03），無顯著差異.

2.2 肌肉組織學分析

在倒置顯微鏡下觀察兩種魚的肌肉切片，可以看出雜交F1和母本草魚的肌纖維紋理清楚，排列緊密，基本結構相同（圖1，彩圖見封三）.肌纖維直徑的測量：參考陳璐等[2]的計算方法，選取一定視野范圍內的肌纖維進行統計，圖像分析系統計算出每根肌纖維的面積，并默認為“圓”的面積，根據s=πr2（r為半徑）自動計算出每根肌纖維的等效直徑，統計結果顯示，如圖2所示，肌纖維直徑大小在30～60 μm范圍內的雜交F1占61%，母本草魚占68%，父本赤眼鱒占38%；纖維直徑在60～80 μm范圍內的雜交F1占28%，母本草魚占25%，赤眼鱒占41%；80 μm以上的肌纖維直徑雜交F1占11%，母本草魚占7%，父本赤眼鱒占21%. 用SPSS軟件進行單因素方差分析，用平均值±標準差來表示，見表4.結果表明，雜交F1的肌纖維直徑與其母本草魚肌纖維直徑差異不顯著（P>0.05），但顯著小于其父本赤眼鱒；雜交F1的肌纖維密度與其母本草魚的肌纖維密度無顯著差異（P>0.05），但顯著大于其父本赤眼鱒.

2.3 相關肉質基因表達分析

以草魚RPL13作為內參，考察COL1A1，COL1A2，CAST三個基因在F1和草魚肌肉中的表達，COL1A1和COL1A2兩個基因在父本赤眼鱒和雜交F1中的表達量無顯著差異（P>0.05），都較母本草魚高且差異顯著（P<0.05）.CAST基因在母本草魚和雜交F1中的表達量無顯著差異（P>0.05），都比父本赤眼鱒低且差異顯著（P<0.05）（如圖3）.

3 討論

肌纖維是組織學特性中較為重要的物理參數，是魚類肌肉品質的重要評價指標[3-6].本實驗統計分析了雜交F1和母本草魚、父本赤眼鱒的肌纖維直徑和肌纖維密度.結果顯示，雜交F1的肌纖維直徑顯著小于父本赤眼鱒，與母本草魚的肌纖維直徑無顯著差異；雜交F1的肌纖維密度顯著大于父本赤眼鱒的肌纖維密度，與母本草魚的肌纖維密度無顯著差異.吳信生[7]等對我國7種地方雞種的組織學研究表明，肌纖維密度與肌肉的嫩度相關比較密切，7個地方雞種肌纖維密度與嫩度呈負相關，肌纖維直徑與嫩度呈正相關，即肌纖維愈細，肌纖維密度愈大，肉質越鮮嫩.劉錚鑄[8]等對波爾山羊雜交后代肌肉組織學特性研究發現雜交后代羊與唐山奶山羊在眼肌肌纖維密度方面差異顯著，臂三頭肌肌纖維密度雖未達到顯著差異，但雜交后代明顯高于唐山奶山羊，說明雜交后代羊比唐山奶山羊的肉質好.本實驗結果顯示，與父本赤眼鱒相比，雜交F1的肌纖維直徑更小，肌纖維密度更大，這表明雜交F1肉質比親本赤眼鱒更鮮嫩.

質構特性是決定其品質的重要因素之一，儀器測定是質構特性的重要評價手段，一定程度上減少了人的主觀因素帶來的評價誤差.胡芬[9]等對5種淡水魚的質構特性進行了相關性分析，得出硬度和彈性是影響魚肉質構特性的主要因素.本實驗中雜交F1肌肉硬度和彈性，顯著高于母本草魚的肌肉硬度和彈性.雜交F1肉質硬度和彈性增強，會使其口感更好.

根據以上實驗結果，作者選出了COL1A1，COL1A2和CAST三個與肌肉嫩度和彈性相關基因， 通過實時熒光定量PCR的方法從分子水平上進一步對上述組織學水平指標做出解釋.鈣蛋白酶系統在細胞內普遍存在，是降解肌原纖維蛋白的主要酶系統，是肌肉蛋白質降解的限速環節，在肌肉的嫩化過程中起著重要作用[10-12].蛋白酶CAST系統在魚類中的相關研究報道不多，只有斑馬魚[13]、虹鱒[14]和草魚的部分mRNA被克隆分離.Dutt等[15]研究表明，Calpastatin表達量的減少都會導致肌肉蛋白水解及肉質嫩度的增加，表明鈣蛋白酶水解作用才是導致肉質嫩化的主要因素.關磊[16]等研究表明鈣蛋白酶抑制蛋白 mRNA 的高表達水平可提高魚類肌肉生長率和魚肉硬度、堅韌性，CAST基因在肌肉中的表達可影響其肉質硬度.本實驗中CAST基因在雜交F1肌肉上的表達量與父本赤眼鱒無顯著差異，但是顯著高于其母本草魚，通過質構實驗得出，雜交F1的肉質變硬，彈性變大，可能也是和CAST基因在肌肉中的表達量提高有關.

Hatae[17]等人研究表明，魚類肌肉的堅韌性與膠原蛋白的含量密切相關.在大西洋鮭[18]研究表明，肌肉中膠原蛋白含量的增加使肌肉具有較高的機械強度，凝聚性增大.李文倩[19]等的實驗中表明，膠原蛋白含量與質構參數均呈正相關，膠原蛋白含量增加能夠改善肌肉質構，較高的肌肉膠原蛋白含量，其肌肉的結構、強度和品質也相對較好.本實驗結果也顯示，COL1A1和COL1A2兩個基因在雜交F1肌肉上的表達量顯著高于在母本草魚肌肉上的表達量，肌肉硬度和彈性也顯著高于母本草魚.

4 結論

綜上所述，雜交F1肌肉彈性大、嫩度高，肉質堅韌，這給人們在選擇水產品時提供了一種新的魚蛋白選擇，同時也豐富了魚類種質資源.

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（編輯 WJ）