乙醇-硫酸銨雙水相提取馬齒莧總黃酮工藝研究

郝紅英，牛美蘭，王 研，樊亞蕾，孫莉紅

(黃河科技學院醫學院，河南鄭州 450063)

乙醇-硫酸銨雙水相提取馬齒莧總黃酮工藝研究

郝紅英，牛美蘭，王 研，樊亞蕾，孫莉紅

(黃河科技學院醫學院，河南鄭州 450063)

摘要[目的]優化乙醇-硫酸銨雙水相提取馬齒莧總黃酮工藝。[方法]采用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧中主要成分黃酮，以總黃酮得率為指標，采用單因素和正交試驗，考察提取溶劑濃度、料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取工藝的影響，確定乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧總黃酮的工藝。[結果]試驗最佳提取條件為脫脂馬齒莧粉末2.0 g，乙醇用量27.50%(W)、硫酸銨16.00%(W)、料液比1∶20、溫度60 ℃、時間40 min，在此條件下，馬齒莧總黃酮提取率為7.23%。[結論]乙醇-硫酸銨雙水相提取法提取效率高、操作簡便，提取劑價格便宜，是一種很有發展前途的提取方法。

關鍵詞乙醇-硫酸銨雙水相；馬齒莧；總黃酮；提取工藝；正交設計

馬齒莧又名馬齒草、長壽菜、五行草等，為馬齒莧科一年生肉質草本植物[1]，具有清熱解毒、散血消腫、抗菌的功效，主治腸炎、菌痢、癰腫、惡瘡、丹毒、蛇蟲咬傷、痔瘡腫毒、濕疹、急性和亞急性皮炎等多種疾病[2]。馬齒莧中的主要成分為黃酮類物質，其具有抗氧化、降糖、抗病毒、抗菌、消炎、抗潰瘍的藥理作用[3-4]。馬齒莧黃酮的提取工藝包括有機溶劑提取法[5]、超聲波法[6]、微波法[7]、酶解法[8]、樹脂法[9]等。近幾年，雙水相萃取技術因設備投資少、操作簡單，被廣泛用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領域，且雙水相萃取體系具有價廉、低毒、較易揮發等特點[10]。筆者采用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧中主要成分黃酮，以總黃酮得率為指標，采用單因素和正交試驗，考察提取溶劑濃度、料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取工藝的影響，確定乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧總黃酮的工藝，為馬齒莧的合理利用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料蘆丁標準樣品(中國藥品生物制定檢定所，生化試劑)，其他試劑均為分析純。馬齒莧(藥店所受中草藥)。電熱恒溫水浴箱(北京市永光明醫療儀器廠)，SHZ-D(III)循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)，7230G可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1標準曲線的繪制。馬齒莧中黃酮類化合物含量的測定參照文獻[11-12]的方法，以蘆丁為標樣測定馬齒莧黃酮類化合物的含量，所得標準曲線回歸方程為Y=0.093 8X+0.000 1(R2=0.999 8)，式中，Y為蘆丁質量濃度(g/mL)；X為吸光度。

1.2.2馬齒莧總黃酮的提取。稱取馬齒莧干細粉(過60目篩)于索氏提取器中，經石油醚脫脂，并除去部分色素。稱取處理樣品2.0 g于 250 mL碘量瓶中，按一定的料液比加入乙醇-硫酸銨雙水相溶液，置于恒溫水浴箱，提取一段時間后，過濾，靜置分層，將濾液用分液漏斗將兩相分開，將醇相提取液高速離心 25 min，即得馬齒莧黃酮類化合物提取液，后經微孔濾膜過濾，精密稱取一定量用甲醇定容至250 mL，以供分析測試用。

1.2.3馬齒莧總黃酮的測定。取2.5 mL樣品溶液至25 mL容量瓶中，加5%(W)的NaNO21 mL，搖勻，放置5 min后加入10%(W)的Al(NO3)31 mL，5 min后再加入4%(W)的NaOH 10 mL，搖勻，用蒸餾水稀釋至刻度，10 min后于7230G 型分光光度計上在510 nm處測定吸光度A，根據蘆丁標準曲線回歸方程，得到提取液濃度，總黃酮提取率按照公式Et=(C×V×D)/W×100%計算，式中，Et為提取率，C為測得的提取液濃度，V為提取液體積，D為稀釋倍數，W為原料的質量。

1.2.4單因素試驗。

1.2.4.1乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響。水浴溫度為40 ℃，固定硫酸銨用量6.4 g[16.00%(W)]、料液比1∶20[m(馬齒莧)∶m(雙水相溶劑)]、提取時間30 min的條件下，稱取處理樣品2.0 g，選擇不同濃度乙醇[25.00%、27.50%、30.00%、32.50%、35.00%(W)]，分別考察其對馬齒莧總黃酮提取率的影響。

1.2.4.2料液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響。水浴溫度為40 ℃，在恒定的乙醇濃度32.50%、硫酸銨用量16.00%、提取時間30 min的條件下，稱取處理樣品2.0 g，選擇不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)，分別考察其對馬齒莧總黃酮提取率的影響。

1.2.4.3提取溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響。在恒定的乙醇濃度32.50%、硫酸銨用量16.00%、料液比1∶25、提取時間30 min的條件下，稱取處理樣品2.0 g，選擇不同超聲波處理溫度(30、40、50、60、70 ℃)，分別考察其對馬齒莧總黃酮提取率的影響。

1.2.4.4提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響。水浴溫度為40 ℃，在恒定的乙醇濃度32.50%(W)、硫酸銨用量16.00%(W)、料液比1∶25的條件下，稱取處理樣品2.0 g，選擇不同提取時間(20、30、40、50、60 min)，分別考察其對馬齒莧總黃酮提取率的影響。

1.2.5正交試驗。 稱取處理樣品2.0 g，以乙醇質量濃度、提取溫度、料液比、提取時間為考察因素設計 L9(34)正交表，并按照此正交表安排試驗。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響。由圖1可知，在硫酸銨用量一定的情況下，隨著乙醇用量的增加，總黃酮提取率逐漸增加，當無水乙醇的用量為32.50%時達最大；此后，隨著無水乙醇用量的增加，總黃酮提取率顯著下降。其主要原因可能是：乙醇濃度過低不利于黃酮的浸出，隨著乙醇濃度的增加，雙水相體系的分相能力增加，乙醇在上層的體積也逐漸增加，總黃酮的溶解度增加，一些脂溶性有機物的溶出量也會增加，抑制了總黃酮的浸出，綜合考慮這些因素，確定最佳的無水乙醇含量為32.50%。

圖1　乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.1　Effects of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.1.2料液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響。由圖2可知，在硫酸銨和無水乙醇用量比例一定的情況下，隨著料液比的增加，總黃酮的提取率逐漸增加，當料液比為1∶25時達最大；此后，隨著料液比的增加，總黃酮提取率開始降低。原因可能是：料液比較小時，溶劑滲透并擴散到細胞內的速度以及黃酮化合物向溶劑中擴散的速度小，如果料液比較大時，雖然有利于溶劑進入細胞內破壞疏水鍵，利于黃酮化合物向溶劑中擴散，但會耗費大量的溶劑和硫酸銨，綜合考慮，料液比選1∶25較好。

圖2　料液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響 Fig.2　Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.1.3提取溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響。從圖3可看出，當提取溫度為40 ℃時，馬齒莧中總黃酮提取率達最大；此后，溫度繼續升高，馬齒莧中總黃酮提取率開始下降。其主要原因是：雖然溫度增加能使分子運動加快，能增加黃酮類化合物的浸出，但也增加了乙醇的揮發，導致總黃酮提取率下降。另外溫度過高時，一定量的總黃酮可能會被氧化破壞。綜合考慮這些因素，選取最佳提取溫度為40 ℃。

圖3　提取溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.3　Effects of temperature on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.1.4提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響。由圖4可見，馬齒莧中總黃酮提取率在20～50 min時隨著提取時間的延長而升高，在50 min時達最大，繼續延長提取時間總黃酮提取率反而下降。原因可能是：在提取初期，馬齒莧中的總黃酮不斷浸出，隨著提取時間的延長，總黃酮的浸出率逐漸達到最大。如果繼續延長，乙醇揮發量增加，會引起總黃酮提取率降低。考慮到提取率以及節約能耗等方面的因素，選取最佳提取時間為50 min。

圖4　提取時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of time on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.2正交試驗在單因素考察的基礎上，為了得到更好的條件，采用 L9(34)正交表來安排正交試驗。由表1可知，各因素對馬齒莧總黃酮提取率影響由大到小依次為提取溫度、料液比、乙醇含量、提取時間，其中提取溫度對馬齒莧中總黃酮提取率的影響最大。由分析結果初步認為，乙醇-硫酸銨雙水相體系提取馬齒莧總黃酮的最佳條件為：在馬齒莧為2.0 g的情況下，硫酸銨為16.00%，無水乙醇用量27.50%、料液比1∶20、溫度60 ℃、時間40 min。

表1　正交試驗設計與結果

2.3平行試驗為進一步驗證正交試驗結果的可考性和重現性，按照所得最佳條件做了3次平行試驗。結果表明，使用該方法優化出了乙醇-硫酸銨雙水相提取馬齒莧總黃酮最佳工藝條件，在該條件下提取率為7.23%，不但提取率高，且試驗的重現性好。

3討論

(1)乙醇-硫酸銨雙水相提取法是一種新型的液-液萃取技術，反應條件溫和，萃取時間短，提取效率高，操作簡便，乙醇、硫酸銨價格便宜，幾乎不存在有機殘留問題，是一種很有發展前途的提取方法。

(2)通過單因素試驗、正交試驗法，優選出馬齒莧總黃酮的雙水相最佳提取工藝：脫脂馬齒莧粉末2.0 g，無水乙醇含量27.50%、硫酸銨16.00%、料液比1∶20、溫度60 ℃、時間40 min，在此條件下，馬齒莧總黃酮提取率為7.23%。

參考文獻

[1] 鄭智音，賈曉斌，舒孌，等.鮮馬齒莧多糖、生物堿和多酚類組分的制備及其降血糖活性研究[J].中草藥，2014，45(18)：2673-2677.

[2] 洪海.馬齒莧藥理作用及臨床應用的研究進展[J].中外健康文摘，2010，7(27)：104-105.

[3] 章愛華，鄧斌，蔣剛彪，等.馬齒莧黃酮提取液抗氧化活性的初步研究[J].食品科技，2008，33(8)：140-143.

[4] 張華芳.羊棲菜提取物的降血糖作用研究[J].時珍國醫國藥，2006，17(2)：3-4.

[5] 章愛華，鄧斌，陳小原.馬齒莧中黃酮類化合物的提取工藝研究[J].農產品加工·學刊，2008(5)：18-19.

[6] 張特立，于春月.馬齒莧中總黃酮的提取工藝研究[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(4)：37-38.

[7] 章愛華，鄧斌，陳小原，等.馬齒莧黃酮類化合物的微波提取及其抗氧化活性研究[J].食品研究與開發，2008，29(7)：1-4.

[8] 翟碩莉，付艷梅.馬齒莧黃酮提取方法研究進展[J].衡水學院學報，2012，14(4)：39-41.

[9] 周毅，曾少嫻，王成蹊，等.大孔吸附樹脂分離純化馬齒莧總黃酮的工藝研究[J].時珍國醫國藥，2011，22(3)：755-757.

[10] 汪建紅，廖立敏，王碧.乙醇-硫酸銨雙水相體系提取檸檬渣中總黃酮研究[J].華中師范大學學報(自然科學版)，2013，41(1)：78-81.

[11] 王仲英，李香蘭.馬齒莧中黃酮類化合物含量的測定[J].太原理工大學學報，2004，35(1)：95- 96.

[12] 趙晨晨，承偉，王立冬.微波輔助提取絡石藤總黃酮的工藝研究[J].中草藥，2012，43(4)：718- 720.

Extraction of Total Flavonoids from Purslane Using Ethanol-Ammonium Sulfate Aqueous Two Phase System

HAO Hong-ying, NIU Mei-lan, WANG Yan et al

(Medical School, Huanghe Science and Technology College, Zhengzhou, Henan 450063)

Abstract[Objective] The aim was to optimize the extraction technology of total flavonoids from purslane using ethanol / ammonium sulfate aqueous two phase system. [Method] The flavonoids from purslane was extracted by using ethanol / ammonium sulfate aqueous two phase system. With total flavonoids yield as indicator, adopting single factor and orthogonal test, effects of solvent concentration, sloid-liquid ratio, time, temperature on extraction process were investigated. [Result] The optimal extraction conditions were: 2.0 g non-fat purslane powder, ethanol 27.50%(W), ammonium sulfate 16.00%(W), solid-liquid ratio 1∶20, temperature 60 ℃, and time was 40 min. Under the above conditions, the extraction rate of total flavonoids was 7.23%. [Conclusion] The extraction efficiency of ethanol-ammonium sulfate aqueous two phase system is high, the operation is simple, and the extracting solvent is cheap, so it is a promising extraction method.

Key wordsEthanol-ammonium aqueous two phase system; Purslane; Total flavonoids; Extraction technology; Orthogonal design

基金項目鄭州市科技局科研項目(20140787)；黃河科技學院大學生實踐創新項目(2015XSCXCY008)。

作者簡介郝紅英(1979- )，女，河南商丘人，副教授，碩士，從事制藥工程與天然產物提取研究。

收稿日期2016-03-15

中圖分類號S 567.21+9；R 284.2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-145-03