菠蘿蜜EST-SSR標(biāo)記開發(fā)及其種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

顧洪濤，李映志，葉春海，陳 亮

(廣東海洋大學(xué)，廣東湛江 524000)

菠蘿蜜EST-SSR標(biāo)記開發(fā)及其種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

顧洪濤，李映志*，葉春海*，陳 亮

(廣東海洋大學(xué)，廣東湛江 524000)

摘要[目的]分析菠蘿蜜EST-SSR標(biāo)記的穩(wěn)定性和多態(tài)性揭示能力，并將其用于菠蘿蜜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。[方法]利用已獲得的菠蘿蜜cDNA文庫中的EST 序列，通過搜索SSR序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后，銀染檢測擴(kuò)增結(jié)果。[結(jié)果]設(shè)計(jì)開發(fā)出479對EST-SSR引物，其中399對能在菠蘿蜜上擴(kuò)增出產(chǎn)物，282對具有多態(tài)性，多態(tài)性擴(kuò)增引物占58.87%；從中選擇60對能夠清晰擴(kuò)增的多態(tài)性引物，對64份菠蘿蜜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，60對EST-SSR引物共擴(kuò)增出188條帶，不同引物的擴(kuò)增條帶數(shù)在2～11，平均3.13條；其中有168條為多態(tài)性條帶，多態(tài)率為89.36%；每對引物的多態(tài)信息含量(PIC)為 0.407 7～0.958 9，平均PIC為0.792 2，這說明供試材料具有較高的遺傳多樣性。系統(tǒng)聚類分析結(jié)果表明，在相似系數(shù)0.688 1處，可將64份菠蘿蜜種質(zhì)資源分成二大類群，在相似系數(shù)0.732 5處，第二大類群又可分為4個(gè)亞群。[結(jié)論]EST-SSR 標(biāo)記的多態(tài)性揭示能力強(qiáng)，用于分析菠蘿蜜種質(zhì)遺傳多態(tài)性的能力強(qiáng)，其應(yīng)用前景廣闊。

關(guān)鍵詞菠蘿蜜；EST-SSR；遺傳多樣性；種質(zhì)資源

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)，又稱木菠蘿、樹菠蘿等，屬于桑科菠蘿蜜屬植物，起源于印度，引入我國已有1400多年的歷史[1]，在我國廣東、廣西、四川、海南和云南等地均有栽培[2]。近年來，隨著菠蘿蜜經(jīng)濟(jì)價(jià)值和用途越來越多地被人們所發(fā)現(xiàn)和重視，菠蘿蜜種植面積不斷擴(kuò)大，對菠蘿蜜新品種的需求也日益強(qiáng)烈。分子標(biāo)記是當(dāng)前廣泛用于農(nóng)作物新品種選育的重要輔助手段，但在菠蘿蜜中可利用的分子標(biāo)記還很少。

EST(Expressed Sequence Tag)是由cDNA文庫克隆、測序獲得的序列，屬于基因編碼區(qū)。EST-SSR標(biāo)記是在EST序列的基礎(chǔ)上，通過搜索SSR序列，根據(jù)其兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)引物開發(fā)的一種分子標(biāo)記。EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)避免了SSR開發(fā)的高成本、耗力耗時(shí)[3]等缺點(diǎn)，卻延續(xù)了SSR標(biāo)記的典型優(yōu)點(diǎn)，即多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性標(biāo)記[4]等。由于EST序列來源于基因編碼區(qū)，與基因功能有關(guān)且高度保守，因此，EST-SSR標(biāo)記可直接鑒定表達(dá)重要農(nóng)藝性狀的基因，且在種間具有高度通用性。

近年來，鑒于EST-SSR標(biāo)記的各種優(yōu)點(diǎn)，EST-SSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定，如小麥[5]、棉花[6]、辣椒[7]、梨[8]、荔枝[9]、越橘[10]等，但在菠蘿蜜中鮮見報(bào)道。筆者在測序獲得的菠蘿蜜EST序列基礎(chǔ)上，分析SSR序列特征并用以開發(fā)EST-SSR標(biāo)記，并將其用于菠蘿蜜種質(zhì)遺傳多樣性分析，以期為進(jìn)一步開展種質(zhì)鑒定、基因定位、圖譜構(gòu)建等提供有力工具。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料從廣東海洋大學(xué)菠蘿蜜種質(zhì)資源圃隨機(jī)選取64份菠蘿蜜種質(zhì)，這64份種質(zhì)主要來自雷州半島、海南和云南等地，只有小部分來自馬來西亞、巴基斯坦等國。采集種質(zhì)的新鮮葉片，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1基因組總DNA提取與檢測。液氮磨樣后，利用改良的CTAB大量法[11]提取基因組DNA，RNase A消化其中的RNA后，進(jìn)行精提取，DNA沉淀用1×TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉腄NA樣品使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測DNA的質(zhì)量和純度。

1.2.2EST-SSR引物開發(fā)。從NCBI中搜索并下載菠蘿蜜的EST序列，外加已獲得的菠蘿蜜EST序列，通過MISA軟件搜索SSR序列，再利用Primer 3.0 Plus軟件設(shè)計(jì)SSR引物，委托北京鼎國生物科技有限公司合成。

1.2.3EST-SSR引物擴(kuò)增與篩選。從64份種質(zhì)中選取8份形態(tài)性狀明顯差異的種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出能擴(kuò)增出明顯條帶的引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中，DNA模板2 μg/mL,dNTPs溶液2 mmol/L，Taq酶50 U/mL，Mg2+溶液2 mmol/L,引物0.2 μmol/L，1×Taq酶Buffer溶液，用去離子水定容至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后，用0.2%的AgNO3染色，含NaOH的甲醛溶液顯色。

1.2.4遺傳多樣性分析。從可擴(kuò)增出清晰條帶的EST-SSR引物中，隨機(jī)選擇60對引物，對收集的64份菠蘿蜜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同“1.2.3”。

1.3數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)EST-SSR標(biāo)記的帶型，有帶記為“1”，無帶記為“0”，空缺記為“—”。針對每對SSR引物，只讀其典型的共顯性SSR主帶(圖1a和1b)；對于不存在共顯性2條帶型的，即讀擴(kuò)增出來的所有帶(圖1c)。統(tǒng)計(jì)所擴(kuò)增的條帶總數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)，并計(jì)算多態(tài)性條帶所占比例和每個(gè)引物的多態(tài)信息含量(PIC)。利用NTSYSpc-Version 2.02j軟件處理“1、0”數(shù)據(jù)，首先用Similarity程序獲得相似系數(shù)矩陣，再利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，獲得64份種質(zhì)的親緣關(guān)系樹狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1菠蘿蜜EST-SSR引物的篩選從菠蘿蜜EST序列共設(shè)計(jì)479對EST-SSR引物，其中有80對引物未擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，能擴(kuò)增出產(chǎn)物的引物399對，占83.30%。在能擴(kuò)增出產(chǎn)物的引物中，有117對引物所擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物無多態(tài)性，多態(tài)性引物282對，所占比例為58.87%。這說明由菠蘿蜜EST序列開發(fā)出的EST-SSR標(biāo)記在菠蘿蜜DNA中有很好的擴(kuò)增效果。

2.2菠蘿蜜EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性從282對多態(tài)性引物中選擇60對能夠擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性高、易統(tǒng)計(jì)的引物，對64份菠蘿蜜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。擴(kuò)增結(jié)果見圖1和表1。60對引物共擴(kuò)增出188條帶，平均每個(gè)引物能擴(kuò)增3.13條帶，不同引物擴(kuò)增的條帶數(shù)在2～11，其中168條帶具有多態(tài)性，多態(tài)率為89.36%。每對引物的PIC為0.407 7～0.958 9，平均PIC為0.792 2，明顯大于0.500 0，這說明EST-SSR在64份菠蘿蜜種質(zhì)上具有較高的遺傳多樣性揭示能力。

2.3菠蘿蜜種質(zhì)的聚類分析利用NTSYSpc-Version 2.02j軟件對64份菠蘿蜜種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建其親緣關(guān)系樹狀圖(圖2)。由圖2可知，60對EST-SSR引物擴(kuò)增出的168條多態(tài)性條帶能夠?qū)?4份菠蘿蜜種質(zhì)資源區(qū)分歸類，種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)在0.688 1～0.994 7，平均相似系數(shù)為0.841 4，這說明64份菠蘿蜜種間親緣關(guān)系較近。在相似系數(shù)0.688 1處，該64份種質(zhì)可分為兩大組，第一組全部為干苞，第二組既有干苞，又有濕苞(13、25、31和32即為濕苞)。在相似系數(shù)0.732 5處，第二組又可分為4個(gè)亞組，4個(gè)亞組中干、濕苞仍未各自獨(dú)立聚為一類，這說明干、濕苞不能在DNA水平上完全分開。5和14號、10和11號的相似系數(shù)為0.994 7，這說明5和14、10和11號菠蘿蜜種質(zhì)很可能來源于同一親本或起源于同一地區(qū)。

注：a、b、c分別為引物JeSB0001、JeSB0170、JeSB0134，M為DL1 000 DNA Maker，1～64為64份菠蘿蜜材料。Note：a，b and c were electrophoresis of JeSB0001，JeSB0170 and JeSB0134，respectively.M was DL1 000 DNA Marker；1-64 were 64 samples of A.heterophyllus.圖1　64份菠蘿蜜種質(zhì)EST-SSR標(biāo)記電泳圖譜Fig.1　Electrophoresis of EST-SSR markers in 64 germplasms of A.heterophyllus

序號Code引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence等位位點(diǎn)數(shù)Allelelocus多態(tài)性位點(diǎn)PolymorphismlocusPIC1JeSB0001F:TGGCTCCACCTCAATGTATAAAG,R:TGTTACATTTCTTGGAT-GAAGGG210.71482JeSB0006F:AATCAACAGATCTGCTCTTTCCC,R:TGAATGTTGAGGATTAGAAGT-GTGA330.87903JeSB0007F:GTATCGCTATTGAGGTTGTGCC,R:AAGAACAATTCGCCACAGAATTA220.73364JeSB0008F:GTGGGTTTTTGGAATCTTCTTCT,R:TGAAAATCCCAAGACTACTG-GAA330.91175JeSB0020F:GAAATTCTCAAGTCCCGAAAGAG,R:ATTCCATCCGGATTTAGAT-CAAC220.75236JeSB0021F:GTCCAGCAACTGTTGGATAGAAT,R:ATCCCGTAT-GTCTCTCTTTCTCC220.77147JeSB0023F:CTCTGCTTCCACTTCTGCTACTC,R:ATCCCCAAGCCCAATCTC220.75758JeSB0030F:AAATTGACCATTTTCCTCTCTCG,R:CTCTGTTTTTGTCCTCTGTCCTC320.83559JeSB0035F:GAAGATGAAGATCTGAGTTGGGA,R:TGATAAGAGTCCAACCTC-CAAAG220.672410JeSB0049F:CTCTTTGGCTTTCATTTCTTCAA,R:TTGAGGATTCTAAATTGAGCT-GC210.631811JeSB0050F:GCACGGATAACTGTTCAGACTTT,R:AAGCTGAACTTGCTCAGTTTT-GT320.871312JeSB0054F:CGACGGTGAAGAAGAAACAGA,R:CAACAAGAAGCCTTTATTTTCCC210.730213JeSB0057F:AGGAACAGAAACAGCACAGAGAG,R:AAGGACCTGATTGGAATTTT-GAA220.759714JeSB0067F:CCGCTTGAAGAAGTCGAGTAAT,R:AGCTCAGAACTCTCAAAAGCTCA320.601115JeSB0080F:GGTATTCGTACATCTTCTCGTCG,R:ATCACGCTCCCGAAGAAAAAC330.887216JeSB0094F:CCAAATACAATAGAGCAACGACC,R:TGTTGTAGTGTATTGAGC-CATCG220.745817JeSB0095F:CCAAATACAATACAGCAATGCCT,R:AGCCATCGTATGTCAT-CAAAGTT210.745118JeSB0096F:GGCCTAAGCAAAGTGTAACTCAA,R:TGCACTCTACTGCGGATA-AAAAT550.937119JeSB0101F:ATTGGAGATTGGCTCTTTGTCTT,R:TACTCCACGATTGTTTGT-GCTAA330.883120JeSB0102F:CACCTGATTTCATTTCTTCCGTA,R:GTACAGAGCATTCAAC-CCAGAAA210.679421JeSB0104F:GAGGCCAAAGAAGAAGATCAAGT,R:GTAAAGCAATGCTCGAAA-CAAAC550.896722JeSB0106F:GTCCTCCTCTTCTCCTTCTCCTT,R:CGAATCGAGGTCTAATTCTTGG220.745823JeSB0107F:ATAGCCTCCTCTTGAACTTCGAC,R:GTCTGTCAGCATCAACGAGT-TCT430.865724JeSB0108F:TATCAACCCAAATCCTTCCTTTT,R:AGGTCAGTGACGTG-TACGAGTTT430.935025JeSB0111F:CTTCAACAGTGTACTGAGAGCGT,R:CGCTAAAAGAGTCCTTG-GAGAAG320.407726JeSB0116F:TAAAGTCGAAGAAGGAATCTCCC,R:CGAGATACCTTAATCCCTCTC-CT440.933127JeSB0120F:ACCTAACCTCCGAATCTAAACCA,R:AAAAAGCACATAGCCTTAGAC-CC550.958928JeSB0123F:GAGAGAATGGTGCTGATAATTCG,R:CACTATGCTGTAATG-GAAGAGGG320.753329JeSB0125F:GTTAGAGGGAAAACCAAAAGAGC,R:ATATTCTCTTCACGAGAC-CCTCC330.742430JeSB0130F:TCATCTTCATCTTCTTCGTTGGT,R:GAGAGAAAATGGAAAGTGAAG-CA440.907631JeSB0133F:CGACGGCGAGTATAGAAGAGTAA,R:AGATTATTACCACTACCGC-CACC440.880332JeSB0134F:CCCATTTTTGTTCCTTTCTTTTT,R:ACCCTAACTTGGGTTTT-GATTTG11110.955733JeSB0135F:AATTTGCAGTTCGTACAGTGACC,R:TTCGATGATACGAAGGTCGAG440.916634JeSB0137F:AAGGAGATCCCCTGTTGCTC,R:CTTCTTCTAGGTGGCGTATCACC550.948935JeSB0145F:GTTCACAAGTTATTGGTGTGCAA,R:TGAAGGTGAAGATGAT-GATTTTGT330.809536JeSB0149F:TAGGCTTTGTATGAAACCCAAAA,R:TACATCAACCAGTAGCTCCA-CAA220.810437JeSB0150F:GGAGAGGAGAGGTCAGTTCTAGC,R:AGCGCTCTAAGAATTCTG-GTTTT330.654538JeSB0155F:ACTGCCTTAGAGAGGGAAAGAGA,R:TACACGCGTTTTACAGCTAAA-CA540.953439JeSB0161F:GAAACATAGGAGACCCACATGAA,R:ATAATGGTATCTCGGAGG-GAAAA220.757340JeSB0165F:ATGTTGAATATAATGGGCACCAG,R:AATGCAACAACAAAGTCAG-GATT310.499841JeSB0166F:GAGAAGGAGGAAGAGGATGAAGA,R:TTCGGATGTAATATGCATA-AGCTC220.779342JeSB0170F:TAGGGCATGAGTTTGACCACTAT,R:ACACCCCTTTTCTTCT-CAAAATC660.955743JeSB0171F:AGTGAGGAGGAGAAGGAGAAAGA,R:AAAAACCACACATCAT-CAAAAGC330.719544JeSB0174F:GAAGGACAATGATGACGAGAATC,R:TGACCCATTTGAGAAT-TCATCTT210.749545JeSB0179F:TCCCTGATCATCAAGTTTTTCTT,R:GCAGGAATTCCCTTCTTTTTA-AC220.764846JeSB0181F:CTGAGCTACAACCACAGCCA,R:CATCAACGACGAACACGAAC440.936447JeSB0185F:AAAACGTTACGCAACTACTGCTG,R:GTAGTGTTGGGGTGTGTCT-TAGC220.717048JeSB0187F:CTCAAGCTTCCCTTCTTCCTTC,R:TCTCGAGGTAGAGGATCTTTTCA430.882949JeSB0190F:GCATACAACGACCAGTTTCATAA,R:GCTCTTGTTGTTCTTAAGGTT-GAA220.608250JeSB0206F:CGAATAAGACCCATACTCATCT,R:AAAGAATTGAACAAGG-GAGAAGG330.733151JeSB0224F:AAGCTTGACCTCATCAATGTAGC,R:CTACATCCACACCTACGCTCTCT210.749852JeSB0233F:CGCAAAGAATCTGATAGAACAGC,R:GATTGACCCCTAAGAAAG-CAACT220.735253JeSB0235F:AAACTCAGAAGCTGTTTCAGGTG,R:AGACATGGACACCTCTGGT-GAAT210.749054JeSB0241F:GGTTTCTGAAATTGTGTTTCCTG,R:TTTTCTCCAAATTAGGGCTA-AGG880.984855JeSB0268F:TGAACTCAACTCTCCCTCTTCAC,R:ACCATCTTCATCATCACCATCAT330.895156JeSB0284F:AGCGTTTCAATGGTTTTAGCAG,R:GTCCTCTTTAACGACGCCTTTT220.545757JeSB0291F:GTCAGGAAATTGAAGCATTTTGG,R:CTGTTTATAATAGCTC-CCGGGTC320.876458JeSB0320F:CAGCAGCAACAGCAAACTAATC,R:TCTGGTTCTGTAAATTGAACTGC220.702959JeSB0326F:GTTGGAATTGCTAACAGTGTAGA,R:GTCTGCATCTCTCGCTTCCT330.894460JeSB0447F:CTTGCCCTTTTTCACTGTTTATG,R:TTTTGATTCTTGTGCAGTTGC-TA220.7186總計(jì)Total1881680.7922

注：13、25、31和32號為濕苞，其余均為干苞。Note:13, 25, 31 and 32 wer wet buds; others were dry buds.圖2　64份菠蘿蜜種質(zhì)資源聚類圖Fig.2　UPGMA dendrogram of the 64 germplasms of A.heterophyllus

3討論

雖然分子標(biāo)記技術(shù)較為成熟，并被廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、基因組比較、遺傳圖譜構(gòu)建、基因組關(guān)聯(lián)分析及QTL定位等，但在菠蘿蜜遺傳分析中的應(yīng)用較少，主要是AFLP、ISSR、RAPD等。王艷紅[12]利用磁珠法發(fā)掘菠蘿蜜SSR分子標(biāo)記，但效率偏低。EST-SSR標(biāo)記由cDNA文庫中的EST序列設(shè)計(jì)而來，開發(fā)成本低，在種質(zhì)資源遺傳分析方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性，而且其呈現(xiàn)的是基因編碼區(qū)變異，是功能基因的直接鑒定與評價(jià)。

在該研究中，由菠蘿蜜EST序列設(shè)計(jì)出的479對SET-SSR引物中，能有效擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物的引物有399對，有效擴(kuò)增率為83.30%，其中能產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物的引物有282對，多態(tài)性擴(kuò)增率為58.87%，高于董清華等[13]開發(fā)的草莓EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性擴(kuò)增率53.00%，顯著高于Eujayl等[14]開發(fā)的小麥EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性擴(kuò)增率16.00%。這表明由菠蘿蜜EST序列開發(fā)SSR標(biāo)記具有較高的效率。

從多態(tài)性擴(kuò)增引物中選擇清晰易讀的EST-SSR引物60對，對64份菠蘿蜜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，60對引物共擴(kuò)增出188條帶，其中具有多態(tài)性的條帶數(shù)為168，占89.36%，顯著高于Li等[15]利用AFLP對50份菠蘿蜜種質(zhì)分析的20.3%，高于葉春海等[16]利用RAPD對雷州半島菠蘿蜜種質(zhì)分析的88.4%。每對引物的PIC在0.407 7～0.958 9，平均PIC為0.792 2，明顯大于0.500 0，這表明EST-SSR標(biāo)記應(yīng)用于菠蘿蜜研究不僅可行，還具有較高的多態(tài)性揭示能力。

該研究聚類結(jié)果仍未能將菠蘿蜜干、濕苞分開，這與王耀輝[17]的研究結(jié)果一致。但聚類分析所獲得的遺傳相似系數(shù)在0.688 1～0.994 7，平均相似系數(shù)為0.841 4，高于王耀輝[17]利用ISSR標(biāo)記分析78份菠蘿蜜種質(zhì)的相似系數(shù)0.502 3～0.944 7和平均相似系數(shù)0.766 6，還高于王艷紅[12]對菠蘿蜜種質(zhì)聚類分析的相似系數(shù)0.576 3～0.965 5和平均相似系數(shù)0.814 0。這可能是因?yàn)?4份菠蘿蜜種質(zhì)資源親緣關(guān)系較近，但也不能排除是因?yàn)镋ST-SSR標(biāo)記來源于cDNA文庫所致。cDNA文庫中的序列來自高度保守的基因編碼區(qū)，正因高度保守，在植物進(jìn)化過程中，發(fā)生突變的概率相對較小，基因間差異也較小。

4結(jié)論

菠蘿蜜的EST-SSR 標(biāo)記是一種高效的功能性標(biāo)記，其引物開發(fā)設(shè)計(jì)過程簡單、省時(shí)省力，PCR擴(kuò)增條帶清晰、效果穩(wěn)定，適用于菠蘿蜜種質(zhì)資源之間的遺傳多樣性分析。該研究由EST設(shè)計(jì)開發(fā)的60對EST-SSR引物不僅能擴(kuò)增出清晰的條帶，且64份種質(zhì)的遺傳多樣性聚類分析結(jié)果體現(xiàn)出較高的多態(tài)性揭示能力。因此，隨著EST數(shù)據(jù)庫中EST序列的豐富，EST-SSR標(biāo)記被越來越多地應(yīng)用于菠蘿蜜種質(zhì)資源研究，為促進(jìn)菠蘿蜜種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 潘志剛，游應(yīng)天.中國主要外來樹種引種栽培[M].北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[2] 李映志，葉春海，豐鋒，等.雷州半島菠蘿蜜種質(zhì)資源研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，33(2)：183-186.

[3] 歐良喜，向旭，狄鳳香，等.SSR分子標(biāo)記在荔枝上的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009，64(S1)：83-87.

[4] 黃啟星，左嬌，孔華，等.11種熱帶植物EST-SSR 標(biāo)記的開發(fā)和多樣性分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2012，33(7)：1208-1214.

[5] 劉澤濤，少華，楊迪，等.小麥穗部組織EST-SSR標(biāo)記引物開發(fā)及其在小麥遺傳多樣性分析中 的應(yīng)用[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2013，33(6)：1093-1099.

[6] 梁維維，張大偉，陳全家，等.棉花EST-SSR新標(biāo)記特征及其遺傳多樣性分析[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36(2)：118-123.

[7] 伍寶朵，胡麗松，范睿，等.基于EST-SSR標(biāo)記的胡椒栽培種質(zhì)遺傳多樣性研究[J].中國熱帶農(nóng)業(yè)，2016，68(1)：52-56.

[8] 王西成，姜淑苓，上官凌飛，等.梨EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)及其在梨品種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用評價(jià)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(24)：5079-5087.

[9] 向旭，歐良喜，陳厚彬，等.中國96個(gè)荔枝種質(zhì)資源的EST-SSR遺傳多樣性分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物，2010，29(6)：1082-1092.

[10] 郭瑞雪.越橘EST-SSR分子標(biāo)記的開發(fā)及遺傳多樣性分析[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[11] 葉春海，李映志，豐鋒.一種利用菠蘿蜜葉片提取高質(zhì)量DNA 的方法[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2005，26(4)：64-66.

[12] 王艷紅.菠蘿蜜SSR分子標(biāo)記的開發(fā)及其在種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[D].湛江：廣東海洋大學(xué)，2010.

[13] 董清華，王西成，趙密珍，等.草莓EST-SSR標(biāo)記開發(fā)及在品種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(17)：3603-3612.

[14] EUJAYL I，SORRELLS M E，BAUM M，et al.Isolation of EST-derived microsatellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J].Theoretical and aplied genetic，2002，104：339-407.

[15] LI Y Z，MAO Q，F(xiàn)ENG F，et al.Genetic diversity within a Jackfruit(ArtocarpusheterophyllusLam.)germplasm collection in China using AFLP markers[J].Agricultural sciences in China，2010，9(9)：1263-1270.

[16] 葉春海，李映志，豐鋒.雷州半島菠蘿蜜種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32(6)：1088-1091.

[17] 王耀輝.菠蘿蜜資種質(zhì)遺傳多樣性分析及核心種質(zhì)的初步構(gòu)建[D].湛江：廣東海洋大學(xué)，2009.

Development of EST-SSR Markers inArtocarpusheterophyllusLam. and Its Genetic Diversity Analysis of Germplasm Resources

GU Hong-tao, LI Ying-zhi*, YE Chun-hai*et al

(Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524000)

Abstract[Objective] To analyze the stability and polymorphism reveal ability of EST-SSR markers in Artocarpus heterophyllus Lam., and to apply in genetic diversity analysis of germplasm resources. [Method] By using the obtained EST sequence in A. heterophyllus cDNA library, SSR sequences were searched, and primer was designed. After PCR amplification, the amplified results were detected by silver staining method. [Result] A total of 479 pairs of EST-SSR primers were designed. Among them, 399 pairs could amplify products in A. heterophyllus DNA, and 282 pairs had polymorphic bands, accounting for 58.87%. Then, 60 pairs of polymorphic primers were selected to analyze genetic diversity among 64 germplasms of A. heterophyllus. Sixty pairs of EST-SSR primers produced 188 bands; and the amplified bands per pair of primers ranged from 2 to 11 with an average of 3.13. Among them, there were 168 polymorphic bands, showing a polymorphic rate of 89.36%. Polymorphic information content (PIC) of each pair primers was 0.407 7 - 0.958 9 with an average PIC of 0.792 2, indicating that the test material had a higher genetic diversity. Cluster analysis showed that 64 A. heterophyllus germplasms were divided into two groups at the similarity coefficient of 0.688 1. The larger group was then divided into four subgroups at the similarity coefficient of 0.732 5. [Conclusion] EST-SSR markers of A. heterophyllus has strong polymorphism reveal ability, and can be used to identify genetic differences among different A. heterophyllus germplasms, showing broad prospects in application.

Key wordsArtocarpus heterophyllus Lam.; EST-SSR; Genetic diversity; Germplasm

基金項(xiàng)目廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020304004)。

作者簡介顧洪濤(1990- )，女，湖北黃崗人，碩士研究生，研究方向：園藝作物遺傳育種。* 通訊作者，李映志，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事園藝作物遺傳育種研究；*通訊作者，葉春海，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事園藝作物遺傳育種研究。

收稿日期2016-03-30

中圖分類號S 602

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-135-05