NaHCO3及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)球等鞭金藻（Isochrysis galbana）生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)和脂肪酸組成的影響

王星宇，黃旭雄，2，3，楊碧蓮

1.農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海2013062.上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海2013063.水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海201306

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NaHCO3及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)球等鞭金藻（Isochrysis galbana）生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)和脂肪酸組成的影響

王星宇1，黃旭雄1，2，3，楊碧蓮1

1.農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306
2.上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海201306
3.水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海201306

摘要：本文研究了培養(yǎng)液中添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL NaHCO3對(duì)球等鞭金藻（Isochrysis galbana）生長(zhǎng)、細(xì)胞蛋白質(zhì)含量及脂肪酸組成的影響，并進(jìn)一步探討了添加適宜NaHCO3后不同培養(yǎng)階段對(duì)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)組成的影響。結(jié)果表明：NaHCO3對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)和細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有顯著影響。批次培養(yǎng)模式下培養(yǎng)液中添加1.5 mg/mL NaHCO3可以獲得最大細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)率。球等邊金藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量隨培養(yǎng)液中NaHCO3添加量的增大而顯著減少；而細(xì)胞中得單不飽和脂肪酸（MUFA）顯著增加，多不飽和脂肪酸（PUFA）顯著降低。在添加1.5 mg/mL NaHCO3的培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)階段的藻細(xì)胞蛋白和脂肪酸組成也有顯著變化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，SFA和MUFA含量逐漸增加，PUFA含量則顯著減少。培養(yǎng)液中添加NaHCO3有助于提升球等鞭金藻作為生物柴油原料的品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：球等鞭金藻；NaHCO3；生長(zhǎng)；蛋白質(zhì)；脂肪酸

球等鞭金藻（Isochrysis galbana）因其無細(xì)胞壁，易消化，富含高不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一直被認(rèn)為貝類等水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物苗種的優(yōu)良的餌料微藻［1］，也一度被視為是生產(chǎn)DHA、EPA等生理活性物質(zhì)的潛力藻種［2，3］。近些年，隨著微藻生物柴油開發(fā)成為微藻應(yīng)用研究的又一熱點(diǎn)，球等鞭金藻因其經(jīng)環(huán)境誘導(dǎo)后可以蓄積高比例油脂的特點(diǎn)，還被視為生產(chǎn)微藻生物柴油的優(yōu)良原料［4］。然而無論是作為餌料微藻還是生物柴油原料，獲得高的生物量及細(xì)胞中高的目標(biāo)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量是球等鞭金藻實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的重要前提。因此，開展培養(yǎng)條件及營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)及細(xì)胞組成的影響研究，是實(shí)現(xiàn)球等鞭金藻產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的基礎(chǔ)性工作。多種環(huán)境因子及培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)素水平等培養(yǎng)條件對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)和細(xì)胞組成的影響已有報(bào)道［5-7］。二氧化碳是藻類進(jìn)行光合作用的底物，培養(yǎng)液中補(bǔ)充二氧化碳在多種微藻培養(yǎng)中已被證實(shí)可以促進(jìn)藻類的生長(zhǎng)［8，9］。同時(shí)，培養(yǎng)液中的二氧化碳可以H2CO3、HCO3-及CO32-形式存在，三者構(gòu)成了培養(yǎng)液中二氧化碳緩沖體系。已有的研究證實(shí)，某些藻類如柵藻（Scenedesmus sp.）［10］、微綠球藻（Nannochloropsis salina）［11］和小球藻（Chlorella kessleri）［12］可以利用HCO3-實(shí)現(xiàn)快速生長(zhǎng)，而另一些藻類培養(yǎng)過程中添加HCO3-則并無促生長(zhǎng)效果［8］。梁英等報(bào)道了培養(yǎng)液中NaHCO3濃度對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)特性有顯著影響［13］。然而，添加NaHCO3對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)組成的影響未見報(bào)道。此外，處于不同生長(zhǎng)階段的藻細(xì)胞其細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)組成會(huì)有巨大差異［14，15］，在培養(yǎng)液中補(bǔ)充NaHCO3后，培養(yǎng)階段對(duì)藻細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)組成的影響也未見報(bào)道。本研究探討了培養(yǎng)液中添加NaHCO3及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)和細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響，以期為高效開發(fā)球等鞭金藻積累基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1藻種來源

球等鞭金藻（Isochrysis galbana）來自于上海海洋大學(xué)微藻藻種室。藻種在溫度25℃，光照強(qiáng)度3000 lux，鹽度26的滅菌海水中采用采用f/2配方培養(yǎng)基［16］進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后用于試驗(yàn)。

1.2培養(yǎng)液中添加不同水平NaHCO3對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)及細(xì)胞組成影響試驗(yàn)

以NaHCO3為碳源，設(shè)置5個(gè)NaHCO3的質(zhì)量濃度分別為0，0.5，1，1.5和2 mg/mL的試驗(yàn)組，每個(gè)梯度3個(gè)平行。培養(yǎng)在1000 mL三角燒瓶中進(jìn)行，初始接種密度3×105cell/mL，將三角燒瓶置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（L：D=18：6），培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度3000 lux，鹽度26。培養(yǎng)周期10 d，每天定時(shí)搖瓶3次。培養(yǎng)期間每日定時(shí)取樣計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度。藻細(xì)胞密度的測(cè)定采用XB-K-25血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，每個(gè)樣品平行測(cè)定4次。

培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，搖勻取30 mL藻液經(jīng)混合纖維素酯濾膜（孔徑為0.45 μm）過濾，置于烘箱中105℃烘干至恒重，得到細(xì)胞干重。另?yè)u勻取1 mL藻液加入1 mL 2N NaOH，95℃水浴10 min，冷卻至室溫，加入1 mL 1.6N HCl中和，離心后取上清，采用福林-酚試劑測(cè)定蛋白質(zhì)含量［17］。剩余藻液經(jīng)離心后，冷凍干燥用于脂肪酸組成的測(cè)定。

1.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)及細(xì)胞組成影響試驗(yàn)

根據(jù)1.2試驗(yàn)結(jié)果，篩選出5組中球等鞭金藻生長(zhǎng)密度最高組（1.5 mg/mL）為放大試驗(yàn)組，將擴(kuò)大培養(yǎng)后的藻液接種于60 L柱狀氣升式光生物反應(yīng)器（高1 m，直徑0.3 m）中培養(yǎng)，初始接種密度3×106cell/mL。反應(yīng)器中內(nèi)置LED光源，光照強(qiáng)度2500 lux，連續(xù)光照，室溫培養(yǎng)。培養(yǎng)周期10 d，培養(yǎng)期間每日定時(shí)取樣計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度，隔天定期收獲5 L藻液用于細(xì)胞蛋白和脂肪酸組成的測(cè)定。

1.4脂肪酸的測(cè)定

細(xì)胞脂肪酸組成的測(cè)定參照Griffiths［18］等的方法，移取一定量藻粉依次加入甲醇鈉（NaOMe，0.5 mol/L）和BF3-甲醇溶液（14%）進(jìn)行兩步甲酯化，提取出含有脂肪酸甲酯的正己烷-甲苯混合物，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶。然后采用氣-質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 7890A/5975C）分析脂肪酸甲酯，毛細(xì)管柱為Supelco Omegawax320（30.0×0.32 mm×0.25 μm）。根據(jù)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma，美國(guó)）的分析圖譜和保留時(shí)間對(duì)樣品脂肪酸進(jìn)行定性分析，利用峰面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸的相對(duì)百分含量，每組樣品平行測(cè)量3次。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

藻細(xì)胞生長(zhǎng)的比生長(zhǎng)率μ計(jì)算公式如下：μ=（lnXt-lnX0）/T

其中，X0為培養(yǎng)初始藻細(xì)胞密度，Xt為經(jīng)T時(shí)間后培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞密度。

根據(jù)脂肪酸組成預(yù)測(cè)微藻生物柴油的品質(zhì)，其中十六烷值（Cetane Number，CN）的計(jì)算參考Piloto-Rodríguez［19］等人的方法進(jìn)行；運(yùn)動(dòng)黏度的計(jì)算參照［20］的方法進(jìn)行；碘值參照［21］的方法進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件（SPSS Inc.，USA）進(jìn)行單因子方差分析（One-Way ANOVA），并用Duncan氏檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，差異顯著性水平為P＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)液中添加不同水平NaHCO3對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)及細(xì)胞組成影響

培養(yǎng)液中添加不同濃度的NaHCO3對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)的影響如圖1所示。在培養(yǎng)前期，碳酸氫鈉添加與否對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞生長(zhǎng)無顯著影響（P＞0.05）。培養(yǎng)第7 d，A組（未添加NaHCO3）的細(xì)胞濃度開始下降，而B、C、D、E組濃度繼續(xù)增加，碳酸氫鈉對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響開始顯現(xiàn)。培養(yǎng)第9 d，D、C和B組藻細(xì)胞密度顯著高于E和A組（P＜0.05），且D、C和B組藻細(xì)胞密度分別達(dá)到最大值，其中D組最大密度為2.64×106cell/mL。培養(yǎng)第10 d，各組藻細(xì)胞密度均較前一日有所下降。

圖1　培養(yǎng)液中添加不同濃度的NaHCO3對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of NaHCO3concentration on growth of the micro-algae Isochrysis galbana

由不同組別的藻細(xì)胞比生長(zhǎng)率（表1）也可知，培養(yǎng)8 d，D和E組比生長(zhǎng)率顯著高于A組（P＜0.05）；培養(yǎng)9 d和10 d，A組比生長(zhǎng)率顯著低于其他組（P＜0.05）。

表1　不同濃度的NaHCO3對(duì)球等鞭金藻比生長(zhǎng)速率（μ）的影響Table 1 Effect of NaHCO3concentration on specific rate of growth of Isochrysis galbana

經(jīng)過10 d培養(yǎng)，培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度對(duì)藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量有顯著影響（P＜0.05）（圖2）。隨著培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度的增加，藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量顯著降低。E組藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量顯著低于其他組（P＜0.05），而C和D組無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于A和B組（P＜0.05），A和B組間細(xì)胞蛋白質(zhì)含量無顯著差異（P＞0.05）。

圖2　培養(yǎng)液中添加不同濃度的NaHCO3對(duì)球等鞭金藻蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of NaHCO3concentration on protein content of Isochrysis galbana

從各處理組球等鞭金藻細(xì)胞脂肪酸組成（表2）可知，球等鞭金藻細(xì)胞中主要的脂肪酸為18：1n9、16：0、14：0、18：4n3、18：3n3和22：6n3。隨著培養(yǎng)液中NaHCO3添加量的增加，不同脂肪酸呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，14：0呈現(xiàn)先降低后升高的變化；16：0和18：1n9含量顯著增加；18：3n3和18：4n3含量顯著降低；22：6n3含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化。隨著培養(yǎng)液中NaHCO3添加量的增加，飽和脂肪酸（SFA）呈波動(dòng)變化，總體增加；單不飽和脂肪酸（MUFA）顯著增加；而多不飽和脂肪酸（PUFA）顯著降低。

表2　培養(yǎng)液中添加NaHCO3對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞脂肪酸組成的影響Table 2 Effect of NaHCO3concentration onfatty acid profiles of the micro-algae Isochrysis galbana

表3　培養(yǎng)液中添加NaHCO3對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞生物柴油品質(zhì)的影響Table 3 Effect of NaHCO3concentration on biodiesel quality of the micro-algae Isochrysis galbana

隨著培養(yǎng)液中碳酸氫鈉添加量的增加，運(yùn)動(dòng)黏度有所提高，碘值逐步減少，十六烷值逐步增大。

2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)添加1.5 mg/mL NaHCO3的球等鞭金藻生長(zhǎng)和細(xì)胞組成的影響

圖3所示為添加1.5 mg/mL NaHCO3條件下球等鞭金藻在60 L光生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)曲線。可知，1～7 d藻細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在第7 d藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值，為4.4×106cell/mL。之后細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。

圖3　添加1.5 mg/mLNaHCO3條件下球等鞭金藻在60 L光生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)曲線Fig.3Thegrowthcurveof Isochrysisgalbanaculturedin60 Lbioreactorwithmediumsupplementedwith1.5mg/mLNaHCO3

培養(yǎng)階段對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量有顯著影響（P＜0.05）（圖4）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量有所降低。第9 d藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量顯著低于其他組（P＜0.05），而第5 d和第7 d藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于第1 d和第3 d（P＜0.05），第1 d和第3 d藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量無顯著差異（P＞0.05）。

圖4　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)添加1.5 mg/mL NaHCO3的球等鞭金藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4EffectofgrowthphaseoncellularproteincontentofIsochrysisgalbanaculturedinmediumsupplementedwith1.5mg/mLNaHCO3

由不同培養(yǎng)階段球等鞭金藻脂肪酸組成可知，在添加1.5 mg/LNaHCO3條件下，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，14：0、16：0、18：1n9和18：2n6含量逐漸增加，18：3n-3、18：4n-3和22：6n3含量顯著減少；SFA 和MUFA含量逐漸增加，PUFA含量則顯著減少（表4）。

表4　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)添加1.5 mg/mL NaHCO3的球等鞭金藻細(xì)胞脂肪酸組成的影響Table4EffectofgrowthphaseonfattyacidprofilesofIsochrysisgalbanaculturedinmediumsupplementedwith1.5mg/mLNaHCO3

表5　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)添加1.5 mg/mL NaHCO3的球等鞭金藻細(xì)胞生物柴油質(zhì)量的影響Table5 EffectofgrowthphaseonbiodieselqualityofIsochrysisgalbanaculturedinmediumsupplementedwith1.5mg/mLNaHCO3

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)黏度逐漸增加，碘值逐漸降低，十六烷值逐步增大。

3　討論

大多數(shù)微藻的生長(zhǎng)是基于光合作用并從外界環(huán)境中獲取可溶性無機(jī)碳用于碳的固定，藻類的光合作用和碳固定過程受環(huán)境因素的調(diào)控，因此，環(huán)境因素的改變會(huì)影響到藻類的生長(zhǎng)及細(xì)胞組成［22，23］。一般認(rèn)為，藻類的光合作用的碳源底物是二氧化碳，然而，在正常海水中，因其pH呈堿性（約8.1左右），超過90%的可溶性無機(jī)碳是以HCO3-形式存在的，且從HCO3-到CO2的自發(fā)轉(zhuǎn)化率低［24］。微藻對(duì)環(huán)境中的HCO3-利用存在兩種機(jī)制［25，26］：一方面，微藻能夠從外界環(huán)境中跨質(zhì)膜運(yùn)輸HCO3-到胞液中，然后在胞液內(nèi)通過胞內(nèi)碳酸酐酶的作用將HCO3-分解成CO2供光合作用所需。另一方面，有些微藻分泌的細(xì)胞外的碳酸酐酶也可以將環(huán)境中的HCO3-催化成CO2，然后CO2跨膜被藻細(xì)胞利用。然而，不同的藻類產(chǎn)生碳酸酐酶的部位及其活性是不一樣的，由此也決定了不同藻類利用環(huán)境中HCO3-的能力是不一樣的［27，28］。White等［11］研究發(fā)現(xiàn)，與不添加組相比，在培養(yǎng)液中添加1 g/L碳酸氫鈉，可以提高四爿藻（Tetraselmis suecica）和微綠球藻（Nannochloropsis salina）培養(yǎng)的細(xì)胞密度，然而，培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度不會(huì)改變四爿藻細(xì)胞的特殊生長(zhǎng)率（SGR），且微綠球藻的SGR隨碳酸氫鈉濃度的增加而降低。Gardner等［29］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中添加碳酸氫鈉會(huì)抑制柵藻（Scenedesmus sp.）的繁殖，但對(duì)三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）不起作用。Yhe等［30］認(rèn)為，培養(yǎng)液中添加1000 mg/L的碳酸氫鈉對(duì)提升小球藻（Chlorella vulgaris ESO-31）生物量是最好的。Pancha等認(rèn)為在BG-11培養(yǎng)基中添加0.6 g/L碳酸氫鈉可以增加?xùn)旁宓纳锪浚?0］。在培養(yǎng)液中添加不同濃度的NaHCO3對(duì)等鞭藻3011和塔溪堤生長(zhǎng)影響明顯，對(duì)綠色巴夫藻的影響程度明顯小于其它兩種金藻。3株海洋微藻的細(xì)胞濃度在NaHCO3濃度最大時(shí)（1600 mg/L）達(dá)最大值［8］。戴玉蓉等［31］發(fā)現(xiàn)在5種微藻的培養(yǎng)液中添加1000 mg/L的NaHCO3，后藻細(xì)胞濃度比不加NaHCO3的對(duì)照組顯著提高。塔胞藻（Pyramimonas sp.）和小球藻（Chlorella spp.）的細(xì)胞濃度都在NaHCO3質(zhì)量濃度為1200 mg/L時(shí)達(dá)到最大值；新月菱形藻（Nitzschia closterium）的細(xì)胞濃度在NaHCO3質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)達(dá)到最大值［8］。本研究中，培養(yǎng)液中添加1.5 g/L的碳酸氫鈉，球等鞭金藻的比生長(zhǎng)率及細(xì)胞密度均是最高的，添加2 g/L的碳酸氫鈉組球等鞭金藻的比生長(zhǎng)率及細(xì)胞密度反而有所下降。上述研究表明，培養(yǎng)液中添加適量碳酸氫鈉對(duì)微藻類的促生長(zhǎng)作用具有種的特異性。有研究表明，四爿藻更喜歡利用胞外碳酸酐酶將HCO3-催化成CO2然后轉(zhuǎn)運(yùn)至進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，而微綠球藻傾向于將主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)在經(jīng)碳酸酐酶作用［32］。對(duì)于那些添加碳酸氫鈉可以促生長(zhǎng)的藻類，適量添加碳酸氫鈉促生長(zhǎng)的機(jī)理推測(cè)與兩方面有關(guān)：一方面，培養(yǎng)液中添加的碳酸氫鈉增加光合作用的底物濃度從而有利于光合作用。已有的研究也證實(shí)，培養(yǎng)液中添加適量碳酸氫鈉可以提升四爿藻和微綠球藻的光合作用效率（Fv/Fm）［11］；另一方面培養(yǎng)液中添加的碳酸氫鈉促進(jìn)了藻細(xì)胞對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收。在添加碳酸氫鈉組培養(yǎng)液中微藻對(duì)培養(yǎng)液中氮的利用顯著增加［11］。而過高的碳酸氫鈉添加量抑制藻類生長(zhǎng)，可能與培養(yǎng)液中過量添加的碳酸氫鈉導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值過高有關(guān)［30］。pH超過藻類的最適范圍會(huì)抑制藻類的生長(zhǎng)，同時(shí)過高的pH會(huì)導(dǎo)致水體中微量礦物元素的沉淀，同時(shí)導(dǎo)致無機(jī)碳向CO32-轉(zhuǎn)變，而光合作用的藻類是不能利用CO32-［33］。

本研究中，培養(yǎng)液中添加碳酸氫鈉對(duì)球等鞭金藻的細(xì)胞蛋白質(zhì)含量和脂肪酸組成有顯著影響，隨著培養(yǎng)液中碳酸氫鈉添加量的增大，藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量逐漸降低，單不飽和脂肪酸（MUFA）顯著增加；而多不飽和脂肪酸（PUFA）顯著降低。類似的結(jié)果在其他藻類中也得到證實(shí)。在添加2 g/L碳酸氫鈉培養(yǎng)液中，微綠球藻細(xì)胞SFA含量顯著增加，MUFA含量顯著降低［11］。藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量隨碳酸氫鈉添加量的增大而降低的原因，推測(cè)與培養(yǎng)液中C/N比增大有關(guān)。培養(yǎng)液中高的C/N比在某種程度上意味著N的相對(duì)缺乏，而氮缺乏會(huì)抑制藻細(xì)胞合成蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)而將能量以脂類和碳水化合物的形式貯存在細(xì)胞中［34］。White等證實(shí)，四爿藻和微綠球藻的細(xì)胞脂肪含量均會(huì)隨培養(yǎng)液中碳酸氫鈉的增加而增加。培養(yǎng)液中添加碳酸氫鈉也有助于柵藻和三角褐指藻細(xì)胞蓄積脂肪［29］。而柵藻細(xì)胞在缺氮和添加碳酸氫鈉的情況下則蓄積大量的碳水化合物［10］。

本研究中，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞蛋白質(zhì)含量降低，SFA和MUFA含量逐漸增加，PUFA含量顯著減少。已有的文獻(xiàn)也證實(shí)了這種規(guī)律。黃旭雄［14］等研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)階段顯著影響微綠球藻的蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、氨基酸含量及脂肪酸組成，批次培養(yǎng)模式下隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量顯著降低，SFA含量顯著增加，PUFA含量顯著降低。等鞭金藻的粗蛋白質(zhì)含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低［35］。培養(yǎng)階段影響藻細(xì)胞生化組成的原因，推測(cè)與培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)鹽的變化有關(guān)。由于藻類生長(zhǎng)過程中不斷吸收利用培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)鹽，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)鹽的缺乏有關(guān)。而營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏，尤其是氮的缺乏，引起藻細(xì)胞生化組成變化的顯著特點(diǎn)就是細(xì)胞蛋白質(zhì)含量降低，脂肪含量增加，飽和脂肪酸增加，多不飽和脂肪酸脂肪酸降低［34］。本研究中，對(duì)比前后2次試驗(yàn)的藻細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)組成，可以發(fā)現(xiàn)在光生物反應(yīng)器中開展不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)藻細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)組成試驗(yàn)中，球等鞭金藻表現(xiàn)出更低的蛋白質(zhì)含量，這與兩次實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件不完全一致有關(guān)。光生物反應(yīng)器中的試驗(yàn)因接種密度高，且連續(xù)充氣，推測(cè)氮脅迫程度相比第一個(gè)試驗(yàn)更加強(qiáng)烈，從而表現(xiàn)出更低的細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。

生物柴油即脂肪酸甲酯，是一種可再生且可生物降解的能源，目前已作為傳統(tǒng)生物柴油的替代品加以利用。據(jù)Kevin J.Harrington［36］的研究表明，作為柴油替代品的理想物質(zhì)應(yīng)當(dāng)具有的分子結(jié)構(gòu)是：有較長(zhǎng)的碳直鏈；含有一定量的氧元素；分子結(jié)構(gòu)盡量沒有或只有很少的碳支鏈；分子中不含有芳香烴結(jié)構(gòu)。而本實(shí)驗(yàn)中球等鞭金藻的主要組成為C16和C18脂肪酸甲酯，因此，可作為一種柴油替代品。運(yùn)動(dòng)粘度是液體流動(dòng)時(shí)內(nèi)摩檫力的量度，其值隨溫度升高而降低，是衡量燃料流動(dòng)性能及霧化性能的指標(biāo)，輕質(zhì)柴油適宜的運(yùn)動(dòng)粘度為1.9～6.0 mm2/s［37］。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)粘度變化不大，在3.78～3.91 mm2/s之間，均符合生物柴油品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。碘值是表示有機(jī)化合物中不飽和程度的一種指標(biāo)，是對(duì)油脂分子碳鏈不飽和度的度量，指100 g物質(zhì)中所能吸收（加成）碘的克數(shù)。而碘值高，CN值就低，CN值表示柴油燃料的點(diǎn)火延遲時(shí)間和燃燒性能，是反映微藻生物柴油的重要指標(biāo)，一般認(rèn)為，適宜的柴油CN值應(yīng)為45～65［39］。若CN太大，則燃料與空氣未經(jīng)適宜混合就予以燃燒而導(dǎo)致燃燒不完全并產(chǎn)生黑煙。若CN太小則燃料發(fā)火困難，不易啟動(dòng)并易導(dǎo)致發(fā)動(dòng)機(jī)爆震［38］。藻細(xì)胞的脂肪酸組成是影響CN的重要因素。本研究中的球等鞭金藻的CN值介于47.56～54.92，均處于生物柴油合適的范圍，且隨著培養(yǎng)液中NaHCO3添加量和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CN有所改善。

綜上所述，一次性培養(yǎng)模式下，培養(yǎng)液中添加NaHCO3可以提升球等鞭金藻培養(yǎng)密度和比生長(zhǎng)率，降低細(xì)胞蛋白質(zhì)含量和脂肪酸中PUFA含量，提升SFA比例，提高運(yùn)動(dòng)黏度和CN值；而增加培養(yǎng)時(shí)間也可以降低藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量和脂肪酸中PUFA比例。添加NaHCO3可作為提升球等鞭金藻作為生物柴油原料品質(zhì)的有效策略。

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Effects of NaHCO3and Culture Phase on Growth, Protein Content and Fatty Acid Composition of Isochrysis galbana

WANG Xing-yu1，HUANG Xu-xiong1，2，3*，YANG Bi-lian1

1. Key Laboratory of Genetic Resources for Freshwater Aquaculture andFisheries，Shanghai 201306，China
2. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture，Shanghai 201306，China
3. Aquatic Animal Genetic Breeding Center Collaborative Innovation Center in Shanghai（ZF1206），Shanghai 201306，China

Abstract：The growth，cellular protein content and fatty acid profile in micro-algae Isochrysis galbana were valuated when the culture was supplemented with 0，0.5，1.0，1.5 and 2.0 mg/mL NaHCO3respectively. Then the protein content and fatty acid profile in cell at different growth phase were also investigated when the culture medium was added with 1.5 mg/mL NaHCO3. The results indicated there were significant effects of NaHCO3supplementation on growth，cellular protein content and fatty acid profiles. The treatment supplemented with 1.5 mg/mL NaHCO3displayed the highest cell density and special growth rate. The cellular protein content decreased significantly along with the increasing supplementation of NaHCO3in culture medium. The monounsaturated fatty acids increased significantly while the polyunsaturated fatty acids decreased significantly along with the increase of NaHCO3supplementation. There were significant differences in cellular protein content and fatty acid profile among the cells which were at a different growth phase when the cells were cultured in the medium supplemented with 1.5 mg/mL NaHCO3. The saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids increased significantly while the polyunsaturated fatty acids decreased significantly along with the culture duration. Therefore it was suggested that NaHCO3supplementation in culture medium was helpful for improving the micro-algae quality for bio-diesel production.

Keywords：Isochrysis galbana；NaHCO3；growth；protein content；fatty acid

中圖法分類號(hào)：S985.4+9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-2324（2016）03-0345-08

收稿日期：2015-10-20修回日期：2015-11-03

基金項(xiàng)目：上海市科技興農(nóng)項(xiàng)目（滬農(nóng)科推字（2013）第2-1號(hào)；滬農(nóng)科攻字（2015）第1-2號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：王星宇（1994-），男，陜西延安人，本科生，研究方向：生物技術(shù)與生物餌料. E-mail：robsten8@126.com