QKI基因多態位點與四川地區漢族人群冠心病的相關性分析

楊馭媒，毛元英，張 可，鄭 翼(.成都市第六人民醫院檢驗科，四川 成都 6005；.四川大學華西醫院心內科，四川 成都 6004)

QKI基因多態位點與四川地區漢族人群冠心病的相關性分析

楊馭媒1，毛元英1，張 可1，鄭 翼2
(1.成都市第六人民醫院檢驗科，四川 成都 610051；2.四川大學華西醫院心內科，四川 成都 610041)

目的 研究QKI基因單核苷酸多態性(SNP)位點與四川地區漢族人群冠心病(coronary heart disease，CHD)發病的相關性。方法 入選570例CHD患者和735例正常對照(NC)樣本，通過病例-對照關聯研究方法，選擇QKI基因上4個標簽SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144)，以單堿基延伸(SNaPshot)方法進行基因分型，并分析其與CHD的相關性。結果 QKI基因4個SNP位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05)。其等位基因頻率在CHD組與NC組之間差異有統計學意義(均P<0.01)。通過單倍體型分析發現，這4個SNP位點處于同一個連鎖不平衡區域，其風險單倍體型TGGG可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051)，而保護型的單倍體型GACA可降低CHD患病風險31%(P= 0.0003)。結論 QKI基因多態性位點與四川地區漢族人群CHD發病顯著相關，其保護型等位基因可降低CHD的易感性。

QKI基因；單核苷酸多態性；冠心病；易感性

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)嚴重危害人類健康。2013年，全球由冠心病導致的死亡人數超過800萬，居所有死亡原因的首位[1，2]。在我國，CHD死亡率逐年上升；2014年，我國CHD死亡率城市為107.5/10萬、農村為105.37/10萬，僅次于腦卒中，居死亡原因第二位[3]。研究表明，CHD是由遺傳因素、環境因素和不良生活習慣共同作用所導致的復雜疾病[4～6]，年齡、性別、吸煙、高血壓、高血脂、高血糖、肥胖、缺乏體力活動以及過量飲酒等均與CHD的發生有關[7]，遺傳因素也是CHD發生發展過程中的關鍵因子[8，9]。隨著全基因組關聯研究(Genome Wide Association Study，GWAS)方法的成功應用，超過50個染色體區域被報道與CHD相關[10，11]。包括與血栓形成、血管收縮/舒張、能量代謝、脂質代謝和炎癥相關的多個基因/位點，其中9p21.3是比較公認的CHD易感區域[10～12]，但仍有部分研究結果因不同種族、不同地區人群以及不同研究方法而存在較大差異。最近，Abbas Dehghan等對15個歐洲人群，共計64297例研究對象：包含 3898例心肌梗塞(myocardial infarction，MI)患者和5465例 CHD患者，進行GWAS meta分析，發現6q26區域QKI基因上的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點rs6941513與心肌梗塞和CHD均顯著相關[13]。該結果是基于歐洲人群的發現，在中國人群中還未見QKI基因與CHD相關性的報道。因此，本研究選取QKI基因上的4個標簽SNP位點(包括rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144)，通過病例-對照關聯研究分析這4個位點與四川地區中國漢族人群CHD發病的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年3月至2015年10月期間，四川大學華西醫院和成都市第六人民醫院確診為CHD的住院患者570例為病例組(CHD組)，平均年齡55.2歲(37～86歲)，其中男性326例(57.2%)。CHD診斷標準依據國際心臟病協會/世界衛生組織臨床命名標準化專題組聯合制定的指南，或者冠狀動脈造影陽性(顯示有至少一支冠狀動脈直徑狹窄≥50%)。選取健康體檢人群735例作為正常對照組(NC組)，平均年齡62.6歲(50～81歲)，其中男性399例(54.3%)。兩組均為四川地區漢族人群，CHD組的血壓、空腹血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白水平均高于NC組(P < 0.05)，一般資料比較見表1。本項研究經醫院倫理委員會批準，所有調查和取樣均征得受試者同意并簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

與對照組比較，*P< 0.05；**P< 0.01

1.2 生化指標檢測 血漿總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、葡萄糖(GLU)測定：受試者過夜空腹(8小時以上)后采集靜脈血；所有生化檢測均在成都市第六人民醫院檢驗科進行。

1.3 基因組DNA提取 采集受試者外周靜脈血5 ml(EDTA抗凝)，加入0.2%NaCl溶液，振蕩，置冰上15分鐘，3000 rpm離心30分鐘，棄掉上清液，用0.2%的NaCl溶液洗滌一次，加入10 mM Tris-HCl (pH=8.0)和10 mM EDTA (4 ml)，10% SDS，25 mg/ml的蛋白酶K和10 mg/ml的RNaseA，加入量分別為4 ml、16 μl和20 μl，混勻，37 ℃過夜孵育，加入4 ml酚/Tris溶液，混勻，3000 rpm離心10分鐘，氯仿抽提兩次，采集水相，加入l/10體積的3M NaAC (pH=5.2)，兩倍體積的無水乙醇，使DNA沉淀，再用70%的乙醇洗滌兩次以獲得基因組DNA，溶解于TE溶液中，然后定量測定在260 nm的吸收率，計算DNA濃度，并將DNA工作液濃度校正至50 ng/μl，置于-20 ℃保存備用。

1.4 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的片段 從基因組數據庫網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db=snp&cmd)獲取QKI基因4個SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144)位點周圍的基因組序列，采用Primer 3.0在線軟件輔助設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成(PCR引物序列見表2)。PCR 反應條件為：95 ℃預變性 5分鐘，經(95 ℃ 30秒，57 ℃ 30秒，72 ℃延伸30秒)× 35個循環，72 ℃延伸7分鐘，12 ℃保溫。

表2 QKI基因4個SNP位點的PCR和SNaPshot引物序列

1.5 基因分型 采用單堿基延伸(SNaPshot)法。PCR產物純化：9 μl PCR 產物(4個位點各2.25 μl)加入1 U堿性磷酸酶(美國Promega公司)以及1 U 核酸外切酶(英國Biolabs公司)，混勻，37 ℃ 30分鐘，75 ℃ 15分鐘。取純化后的產物1μl，分別加入4個SNaPshot引物各0.2 μl(SNaPshot引物序列見表2)，SNPshot Multiplex試劑1μl(美國ABI公司)，ddH2O補足5 μl。反應條件：96 ℃1 分鐘，經(96 ℃ 10秒，50 ℃ 5秒，60 ℃ 30秒)× 25個循環，12 ℃保溫。5 μl上述產物中加入1 U堿性磷酸酶，混勻，37 ℃ 15分鐘，75 ℃ 15分鐘。取上步產物1 μl，加入HD 9 μl，ABI 3730XL測序儀檢測基因型，通過Genemap軟件讀取基因分型情況。

1.6 統計學方法 所有統計分析使用SPSS 19.0統計軟件。單倍型分析采用Haploview 4.2軟件。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。Hardy-Weinberg 平衡、基因型、等位基因頻率的組間分布比較采用χ2檢驗，應用多因素回歸分析基因多態性與CHD的相關性。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 QKI基因SNP位點基因型分布情況 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，4個位點的基因型在CHD組和NC組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05，表3)，說明本研究資料具有群體代表性。CHD和NC組間4個位點的基因型分布比較，差異均有統計學意義(均P< 0.01)；各自小等位基因的純合子對于CHD的發生具有保護作用。見表3。

表3 兩組QKI基因4個SNP位點中基因型分布情況

2.2 QKI基因SNP位點在CHD組和NC組間的等位基因頻率比較 校正年齡、性別等參數之后，CHD患者(CHD)組和對照(NC)組QKI基因上4個SNP位點的等位基因頻率比較，差異均有統計學意義(均P< 0.01)，見表4。

表4 兩組QKI基因4個SNP位點等位基因頻率比較

2.3 連鎖不平衡和單倍體型分析 采用Haploview 4.2 軟件對QKI基因4個SNP位點進行分析，結果顯示，這4個SNP位點處于同一連鎖不平衡區域(linkage disequilibrium block，LD)。進一步比較4個位點所組成的單倍體型發現，共產生6個單倍體型，其中風險單倍體型(H1：TGGG)可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051，表5)，而保護型的單倍體型(H2：GACA)則可降低CHD的患病風險31%(P= 0.0003)，見表5。

3 討論

近年來，GWAS已經成功應用于多種復雜疾病的易感基因研究，包括老年黃斑變性、糖尿病、肺癌和結腸癌等。但關鍵問題是GWAS的結果是否適用于不同種族以及不同人群；因此，要鑒定出真正的疾病易感基因，還需要對GWAS結果在其他獨立樣本人群中進行驗證。本研究針對最近的一項歐洲人群CHDGWAS meta分析的結果[13]，在四川地區漢族人群中進行了進一步的驗證。選取QKI基因上4個SNP位點(rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144)在570例CHD組和735例NC組中進行基因分型，并對其基因型和等位基因頻率在兩組之間統計比較。發現這4個SNP位點均與CHD發病顯著相關，其小等位基因可以降低CHD的易感性，本研究結果證實了歐洲人群的發現。

表5 QKI基因4個SNP位點的單倍體型分析

QKI基因編碼QUAKING蛋白，是一類RNA結合蛋白，對基因表達起著關鍵性的調控作用[14，15]。功能學研究表明，QKI對血管平滑肌細胞的收縮具有重要調控作用，抑制QKI活性可以促進血管損傷時的纖維化進程[16]。QKI的RNA結合活性在單核細胞分化為巨噬細胞的過程中有著舉足輕重的作用[17]。單核細胞轉化為巨噬細胞時都伴隨著QKI表達的降低，這在斑塊內出血導致的動脈粥樣硬化損傷中均能檢測到。QKI的低表達同時也會延緩單核細胞分化為巨噬細胞的進程，干擾其形成泡沫細胞的能力，并且阻滯動脈粥樣硬化損傷過程中單核細胞的滲透[17]。

結合這些功能研究和遺傳學的結果，發現QKI在炎癥反應過程中起著一定作用，可以作為心血管疾病潛在的治療靶點。進一步研究QKI基因及其編碼蛋白的功能和作用機理將有助于CHD的早期診斷及精準防治。

[1] GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators. Global，regional，and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death，1990-2013：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013 [J]. Lancet，2015，385：117-171.

[2] Moran AE，Forouzanfar MH，Roth GA，et al. The global burden of ischemic heart disease in 1990 and 2010：the Global Burden of Disease 2010 study [J]. Circulation，2014，129(14)：1493-1501.

[3] 中國心血管病報告編寫組. 《中國心血管病報告2015》概要[J]. 中國循環雜志，2016，31(6)：521-528.

[4] Chilton R. Pathophysiology of coronary heart disease：a brief review [J]. J Am Osteopath Assoc，2004，104(9 Suppl 7)：S5-S8.

[5] Pjanic M1，Miller CL，Wirka R，et al. Genetics and Genomics of Coronary Artery Disease [J]. Curr Cardiol Rep，2016，18(10)：102.

[6] McPherson R，Tybjaerg-Hansen A. Genetics of Coronary Artery Disease [J]. Circ Res. 2016，118(4)：564-578.

[7] Go AS，Mozaffarian D，Roger VL，et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update：a report from the American Heart Association [J]. Circulation，2014，129：e28-e292

[8] Lloyd-Jones DM，Nam BH，D’Agostino RB，et al. Parental cardiovascular disease as a risk factor for cardiovascular disease in middle-aged adults：a prospective study of parents and offspring [J]. JAMA，2004，291(18)：2204-2211.

[9] Marenberg ME，Risch N，Berkman LF，et al. Genetic susceptibility to death from coronary heart disease in a study of twins [J]. N Engl J Med，1994，330(15)：1041-6.

[10]Deloukas P，Kanoni S，Willenborg C，et al. Large-scale association analysis identifies new risk loci for coronary artery disease [J]. Nat Genet，2013，45(1)：25-33.

[11]Nikpay M，Goel A，Won HH，et al. A comprehensive 1000 Genomes-based genome-wide association meta-analysis of coronary artery disease [J]. Nat Genet，2015，47(10)：1121-1130.

[12]Samani NJ，Erdmann J，Hall AS，et al. Genomewide association analysis of coronary artery disease [J]. N Engl J Med，2007，357(5)：443-453.

[13]Dehghan A，Bis JC，White CC，et al. Consortium. Genome-Wide Association Study for Incident Myocardial Infarction and Coronary Heart Disease in Prospective Cohort Studies：The CHARGE Consortium [J]. PLoS ONE，2016，11(3)：e0144997.

[14]Apponi LH，Corbett AH，Pavlath GK. RNA-binding proteins and gene regulation in myogenesis [J]. Trends Pharmacol Sci，2011，32：652-658.

[15]Chénard CA，Richard S. New implications for the QUAKING RNA binding protein in human disease [J]. J Neurosci Res. 2008，86：233-242.

[16]van der Veer E，de Bruin RG，Kraaijeveld A，et al. Quaking，an RNA-binding protein，is a critical regulator of vascular smooth muscle cell phenotype [J]. Circ Res，2013，113(9)：1065-1075.

[17]de Bruin RG，Shiue L，Prins J，et al. Quaking promotes monocyte differentiation into pro-atherogenic macrophages by controlling pre-mRNA splicing and gene expression [J]. Nat Commun，2016，7：10846.

Association Study between SNPs in the QKI Gene and Coronary Heart Disease in a Sichuan Han Chinese Population

YANGYu-mei1，MAOYuan-ying1，ZHANGKe1，ZHENGYi2
(1.ClinicalLaboratory，No.6People’sHospitalofChengdu，Chengdu610051，China；2.DepartmentofCardiovascularMedicine，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

ZHENGYi

Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the QKI gene and coronary heart disease (CHD) in a Sichuan Han Chinese population. Methods Four SNPs (rs7756185，rs6941513，rs7745161 and rs7751144) in the QKI gene were genotyped by the SNaPshot method in a cohort composed of 570 patients with CHD and 735 normal controls of Han Chinese descent. Results All the genotype frequencies of these SNPs were in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P> 0.05). We found that these four SNPs were significantly associated with CHD in this cohort (均P< 0.01). These four SNPs were in the same linkage disequilibrium (LD) block. The risk haplotype TGGG generated by the four SNPs showed significant association with CHD (P= 0.0051，OR=1.25)，and the protective haplotype GACA also showed significant association with CHD (P= 0.0003，OR=0.69) in this cohort. Conclusion Our results suggest that genetic variants in the QKI gene were significantly associated with CHD in the Sichuan Han Chinese population.

QKI gene；single nucleotide polymorphism；coronary heart disease；susceptibility

國家自然科學基金資助項目(編號：30900626)

鄭 翼

R541.4；R394.3

A

1672-6170(2016)06-0019-04

2016-05-11；

2016-10-25)