石蠟切片技術在本科教學中的應用

王樹蕓 韓秀蘭 霍學慧 畢建杰 王啟柏 李圣福 郭風法

【摘要】石蠟切片技術是一門非常實用的實驗技術，但由于其制作步驟繁瑣、耗時長，很難應用到本科教學中。經本實驗改良的石蠟切片釕紅染色法具有簡單、易操作、染色效果好，學生容易掌握的特點，所需課時量僅13課時。將石蠟切片技術與高校實驗課程相結合，利于該技術在本科教學中廣泛推廣。

【關鍵詞】石蠟切片 釕紅染色法 本科教學

【基金項目】1.山東農業大學教研項目“數字化植物教學標本園建設”；2.山東農業大學教研項目“農科類數字化實驗教學中心建設”。

【中圖分類號】G64 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089（2016）05-0172-02

石蠟切片是進行組織學、生物學研究的常用實驗方法。石蠟切片包括標本采集固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、展片、烤片、烘片、脫蠟、染色、封片等一系列步驟制成透明的薄片，通過光學顯微鏡觀察，可以觀察植物組織的細胞結構和狀態。但因其制作步驟繁瑣，耗時長，一般不列為本科教學的實驗內容。而石蠟切片技術應用范圍廣、實用性強，所以本實驗通過改良、簡化其步驟，使這門技術可以更好的應用到本科實驗教學中。

目前，各大高等院校對大學生動手實踐能力的培養，已成為教育改革的重要內容。實驗教學是培養學生實踐能力的重要手段，是理論課替代不了的。所以，將石蠟切片技術應用到本科實驗教學中，對教育改革可以起到推動作用。

一、材料與方法

1.實驗材料

山東農業大學南校區校園中的櫻花樹葉或者楊樹葉。

2.實驗試劑和器材

無水乙醇、二甲苯、冰醋酸均為天津凱通生產

石蠟為SIGMA中國有限公司生產的蠟片，熔點52℃-56℃

中性樹膠為上海生工生產

卡諾固定液：無水乙醇：冰醋酸=3：1，于青霉素小瓶貯存，現用現配。

明膠（粘片劑）：1g明膠溶于100ml蒸餾水放在36℃烘箱，全部溶解后，再加15ml甘油，2g石炭酸，完全溶解后，分成小瓶，儲存在細口瓶中備用。

釕紅染色液：0.04g釕紅固體染料溶解于200ml蒸餾水中，現用現配。

15ml注射器，用于快速抽氣。

以上所述溶劑都由實驗老師提前配制準備好。

3.實驗儀器

半自動石蠟切片機為浙江省金華市科迪儀器設備有限公司生產，型號是YZB。

電熱恒溫鼓風干燥箱為上海新苗醫療器械制造有限公司，型號是DHG-91435-11。

4.實驗步驟

步驟1.取材固定

將新鮮材料剪成0.5cm見方的小塊，立即放入固定液中殺死固定，存于4℃冰箱固定12-24小時。此步驟于上一次實驗課快要結束時進行，耗時10min左右。

技術要點：

固定的目的是利用化學藥品將活細胞迅速殺死，使植物材料以保持固有形態和結構。所以，取材一定要新鮮、完整、快速，防止葉片失水過多，造成組織萎蔫變形，不利于觀察。

卡諾固定液中的冰醋酸滲透力強而快，能溶解脂肪，可保存蛋白質不變質，是染色體很好的保存劑，組織發脹，可阻止酒精、甲醛等引起的收縮，采用注射器抽氣可排除材料內氣泡的干擾，加速固定液的滲透，更好的保存材料細胞的原有狀態。

注意事項：

（1）應力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。

（2）組織塊不易過大過厚，必須小于2cm×1cm×0.5cm，尤其是組織塊厚度必須控制在0.3cm以內。

（3）固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組織20倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。

（4）注射器抽氣時應注意，不可抽取過度，保持抽取狀態30s，反復3次即可。

步驟2.清洗脫水

上午課時，上課教師指導學生將前一天實驗課固定的材料70%酒精漂洗至無醋酸氣味，再移到70%酒精，靜置20min（期間經常晃動）。然后依次換80%酒精20min→95%酒精（加署紅）20min→無水乙醇60min→無水乙醇60min→無水乙醇60min。此步驟需要耗時4課時，上課教師在實驗間歇把本次試驗的內容、步驟、注意事項和意義向學生講解清楚。

技術要點：

脫水這一步至關重要，為了減少組織材料的急劇收縮，應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行。而徹底脫水也是透明和浸蠟順利進行的保證。

步驟3.透明浸蠟

下午課時，上課教師指導學生將材料依次更換：無水乙醇：二甲苯=3：1溶液 30min→無水乙醇：二甲苯=1：1溶液 30min→無水乙醇：二甲苯=3：1溶液 30min→100%二甲苯 20min→100%二甲苯 20min。然后加入與二甲苯等體積的的蠟片，置于42℃烘箱。本次實驗耗時3課時，上課教師下課前要求學生晚9：00換蠟一次，換蠟后置于60℃烘箱，此后兩天內上午和晚上各換蠟一次。

步驟4.包埋切片

上課時，上課教師先指導學生疊包埋用的紙船，然后進行包埋。包埋好的蠟塊放事先預冷的冰水中，置于冰箱1h，然后進行授課，將本節課的實驗內容跟大家講解清楚，1h后取出進行修塊、切片、貼片、展片、烤片后置于木質切片架于烘箱中烘片，本次實驗共計耗時約3課時。

技術要點：

本實驗采用石蠟取代透明劑二甲苯，使石蠟浸入組織并起支持作用。以石蠟為媒介，使植物組織達到一定的硬度，可以通過切片機切成8um厚的蠟帶，將植物組織的結構清晰的呈現出來。

注意事項：

（1）包埋時順時針輕輕搖晃盛有組織材料和石蠟的小瓶，將材料晃起，倒入紙船中，并將材料一字擺開，中間間隔適當的距離，然后將紙船底部慢慢浸入事先準備好的冷水中，不要完全浸沒，雙手捏緊紙船兩端，直至表層石蠟凝固。動作要迅速，防止石蠟受冷凝固。

（2）包埋好的蠟塊用刀片修成規整的梯形，以利于下一步切片時形成蠟帶。

（3）粘片劑明膠不能過量，過量反而不粘

（4）展片時蠟片的光面向下，不要滴加太多水，蠟帶能夠完全展開即可。

步驟4.染色封片

將烘好的片子通過染色盒進行二甲苯脫蠟，無水乙醇2min→無水乙醇 2s→70%酒精1min→30%酒精1min→蒸餾水1min逐級復水，釕紅染色1min，再脫水透明，中性樹膠封片。

上課教師指導學生在普通光學顯微鏡下觀察制得的石蠟切片，觀察植物葉片的植物葉片的組織結構，以及柵欄組織和海綿組織的區別，并繪制成圖，作為本次試驗的實驗報告。本次課共計耗時3課時。

技術要點：

烘片后的切片需脫蠟及復水才能在水溶性染液中進行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級經純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。如果染料配制于酒精中，則將切片移至與酒精近似濃度時，即可染色。如果不經過復水，材料脫蠟后直接進入染色劑中，材料將會嚴重變形，甚至難以染色。

染色的目的是使細胞組織內的不同結構呈現不同的顏色和足夠強的差異以便于觀察。經染色可顯示細胞內不同的細胞器及內含物以及不同類型的細胞組織。本實驗采用的釕紅主要染細胞間層，配置簡單，染色穩定，且染色時間短，顏色鮮明，不容易染色過度，染出來的切片植物組織結構清晰，便于普通顯微鏡觀察。

注意事項：

（1）脫蠟及以后過程中，必須保證載玻片載有材料的一面，在玻片架上朝向一致。

（2）將載玻片從二甲苯中取出，務必使有材料的一面朝上。

（3）二甲苯極易揮發，載玻片從二甲苯中取出后要迅速滴膠，以免材料暴露于空氣中，吸收的水分而導致實驗失敗。

（4）注意中性樹膠的濃度，太稠時，用適量二甲苯稀釋。

（5）膠的數量以剛好不溢出蓋玻片為宜（200ul移液器滴加1滴）。

二、結論與分析

本實驗共計耗時13課時，比較系統、連貫，而且步驟已簡化，簡單易操作，學生在短時間內就能夠熟練掌握和操作。此方法將以前只能從書本上看到的植物顯微結構，通過自己的雙手親自做出來，會使學生印象更加深刻。所以將石蠟切片技術應用在學校的本科教學中，具有深遠意義。

實驗教學在大學教學過程中占據重要位置，是理論教學外培養學生實踐能力、創造能力的重要手段，也是輔助理論教學重要的一部分，實驗教學使得課堂上講的內容及方法能付于實踐，加深和鞏固課堂教學的內容。

目前，各大學校本科實驗教學課程，普遍選用一些耗時短，簡單的常規實驗，但一般實用性不強。而石蠟切片技術在學生繼續深造及今后的科研工作中大有裨益，所以在本科實驗教學中廣泛推廣石蠟切片這門應用范圍廣、實用性強的常規技術在學校的本科教學中推廣勢在必行。

參考文獻：

[1]侯春春，徐水.淺析影響石蠟切片質量的關鍵因素[J].中國農學通報，2009，25（23）：94-98.

[2]楊捷頻.常規石蠟切片方法的改良[J].生物學雜志，2006，23（1）：45-46.