DC-CIK對肝癌患者免疫平衡的影響及臨床療效研究

賈 蓓，劉建寧，張 歲，馬文波，柳立平

(1.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院肝病中心，河北 石家莊 050031;2. 河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050051)

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·論 著·

DC-CIK對肝癌患者免疫平衡的影響及臨床療效研究

賈 蓓1，劉建寧2*，張 歲1，馬文波1，柳立平1

(1.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院肝病中心，河北 石家莊 050031;2. 河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050051)

目的觀察樹突狀細胞-細胞因子誘導殺傷細胞(dendritic cell-cytokine induced killer cell,DC-CIK) 治療對原發(fā)性肝癌患者體內免疫平衡的影響及臨床療效。方法選取原發(fā)性肝癌患者30例為觀察組，在采用常規(guī)保肝治療的同時聯(lián)合DC-CIK免疫治療方法；另選擇健康志愿者26例為對照組。比較2組T細胞亞群、Th1/Th2細胞因子水平。比較觀察組治療前后肝、腎功能及甲胎蛋白的水平變化，并評價其生活質量。結果治療后觀察組外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+細胞比率顯著高于治療前(P<0.05)，CD8+、CD4+/CD8+比值與治療前差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后觀察組外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD3+CD56+、CD4+/CD8+與對照組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后觀察組外周血中白細胞介素2(interleukin,IL-2)、γ干擾素高于治療前，但低于對照組，IL-4低于治療前，但高于對照組(P<0.05)；治療前后2組IL-10差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。觀察組肝、腎功能指標治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，治療后甲胎蛋白水平較治療前明顯降低(P<0.05)。評估觀察組生活質量，其中提高19例，穩(wěn)定6例，下降5例，總提高率為63.3%(19/30)。結論DC-CIK免疫治療可以有效提高臨床療效，改善機體的免疫平衡狀態(tài)，增強機體的免疫功能，提高患者的帶瘤生存率，值得臨床推廣應用。

肝腫瘤；細胞因子誘導殺傷細胞；免疫功能

近年來隨著細胞免疫學和分子生物學的發(fā)展，惡性腫瘤的免疫治療已經在臨床上廣泛應用，并取得了一定療效。生物免疫治療是在腫瘤免疫學科和生物工程技術迅猛發(fā)展下催生的一種全新的腫瘤治療方法，其從體外補充、誘導、活化機體的免疫調節(jié)系統(tǒng)，調動細胞活性因子，調整各種免疫性殺傷反應，主要通過調動宿主的天然防御機制或給予機體某種物質來取得抗腫瘤效應，即通過使用一些生物反應調節(jié)劑來增強機體抵抗力，從而達到殺滅和抑制腫瘤生長的目的。機體免疫功能低下或免疫耐受狀態(tài)、或抗原遞呈細胞的功能降低等多因素，使腫瘤細胞逃避機體的免疫系統(tǒng)攻擊，是目前腫瘤形成的重要機制。應用單一的手術治療方法僅能消除肉眼可見的瘤體，而大量進入血液循環(huán)的腫瘤細胞才是腫瘤早期轉移以及腫瘤復發(fā)的關鍵因素，因此單一手術治療效果并不理想。樹突狀細胞-細胞因子誘導殺傷細胞(dendritic cell-cytokine induced killer cell,DC-CIK)是目前臨床上應用的高效活化腫瘤特異性T細胞，能有效攻擊腫瘤細胞[1]。原發(fā)性肝癌屬于臨床常見病，具有較高的臨床發(fā)病率，可嚴重影響患者的健康狀態(tài)[1-3]，是嚴重威脅人類健康的主要疾病之一，也是癌癥死亡的主要原因[4]。本研究應用DC-CIK治療中晚期原發(fā)性肝癌患者，取得了較好的療效，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月—2015年1月河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院經病理及臨床檢查確診為原發(fā)性肝癌患者30例(觀察組)，其中男性24例，女性6例，年齡35～74歲，平均(62.35±3.53)歲；結節(jié)型肝癌13例，塊狀型肝癌11例，彌漫型肝癌4例，小肝癌2例；單發(fā)病灶18例，多發(fā)病灶12例；腫瘤直徑4～13 cm，平均(7.75±1.22) cm。納入標準：①年齡>18歲，肝功能Child-Pugh分級A或B級；②無手術指征的肝癌患者或肝癌術后需要輔助介入治療的患者；③預計生存期超過半年，并且簽署DC-CIK治療知情同意書；④外周血白細胞計數(shù)>3.0×109/L。排除標準：①過敏體質者或有嚴重的過敏史；②全身衰竭、生命體征不正常以及不能配合檢查者；③全身感染或者局部嚴重感染需要進行抗感染治療者；④合并多器官功能障礙者(心、腦、肺、腎、肝等)；⑤傳染性疾病(如艾滋病、梅毒、活動性結核等)；⑥嚴重自身免疫性疾病患者；⑦嚴重凝血機制障礙。選取門診健康志愿者26例為對照組，男性19例，女性7例，年齡28～71歲，平均(60.52±4.43)歲。2組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

所有肝癌患者均采用常規(guī)性治療措施(保肝等對癥支持治療)，同時給予DC-CIK免疫治療。

本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準，患者或其授權家屬均簽署DC-CIK免疫治療知情同意書。

1.2 DC-CIK制備

1.2.1 外周血單個核細胞分離 將原發(fā)性肝癌患者抗凝外周全血100 mL經淋巴細胞分離液梯度離心處理(500 g×10 min)后，取界面層單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，經離心洗滌后其細胞數(shù)為(1～3)×107，留取備用。

1.2.2 CIK培養(yǎng) 用AIM-V無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度為(4～6)×106/mL，置于37 ℃、5%的CO2中培養(yǎng)2 h。收集非貼壁細胞，用含AIM-V培養(yǎng)基調整細胞濃度約為(2～3)×106/mL，加入γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)1 000 U/mL，24 h后加入重組白細胞介素2(interleukin,IL-2) 1 000 U/mL，CD3McAb 50 μg/L，IL-1 100 U/mL，觀察細胞的生長情況、計數(shù)并補充培養(yǎng)基。

1.2.3 CD細胞培養(yǎng) 在CIK制備過程中收獲的貼壁PBMC中加入AIM-V培養(yǎng)基含粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)1 000 U/mL和重組IL-4 1 000 U/mL，置于37 ℃、5% 的CO2中培養(yǎng)，第3天半量補充含上述濃度細胞因子的AIM-V培養(yǎng)基；第5天加入腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)1 000 U/mL促進細胞成熟。

1.2.4 成熟DC、CIK共培養(yǎng) 將培養(yǎng)得到的成熟DC按1∶10的比例加入CIK培養(yǎng)液中，共培養(yǎng)7～9 d。隔天換液1次，同時補充細胞因子。

1.3 細胞回輸 在細胞培養(yǎng)結束前取樣進行無菌實驗檢測，細菌、真菌和支原體檢測合格后，再收集細胞，錐蟲藍染色檢測細胞活力應在80%以上，同時進行流式細胞分析。在患者回輸細胞前留取培養(yǎng)液用丫啶橙染色或革蘭染色，再追加1次污染檢測。此外還要對每一批細胞最終制劑留樣檢測。DC-CIK分2～4次進行外周靜脈連續(xù)回輸，輸注1次/d，細胞總數(shù)均>109。每3次為1個療程，根據(jù)病情進行3～6個療程?；剌敽?～3 h內密切觀察患者有無發(fā)燒、過敏反應等不良反應。

1.4 外周血T細胞亞群檢測 患者治療前和治療后4個療程后采外周抗凝血，應用流式細胞儀檢測T細胞亞群，CD3+、CD4+、CD8+、CD3+CD56+、CD4+/CD8+及Th1/Th2細胞因子水平，評價患者的免疫功能。

1.5 安全性評價

1.5.1 臨床療效 隨訪患者治療后3個月甲胎蛋白及肝功能指標(丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶)變化。

1.5.2 不良反應觀察 靜脈回輸過程中及回輸后24 h內密切觀察患者的各種反應，包括精神狀態(tài)變化，食欲及睡眠狀況改變，是否出現(xiàn)發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹痛、皮疹、乏力、肌肉酸痛等不良反應。

1.5.3 生活質量評估 參考卡氏功能狀態(tài)評分及疼痛程度、食欲等的改變來評估生活質量的改善。治療后卡氏功能狀態(tài)評分比治療前提高>10分為改善，提高或下降在10分以內為穩(wěn)定，下降>10分為惡化；總提高率=(改善+穩(wěn)定)/總例數(shù)×100%。

1.5.4 腫瘤進展和生存觀察 評估3個月、6個月、1年的生存率。

2 結 果

2.1 2組治療前后T細胞亞群水平比較 治療前觀察組外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+、CD4+/CD8+均低于對照組(P<0.05)，CD8+與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后觀察組外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+細胞比率均顯著高于治療前(P<0.05)，CD8+、CD4+/CD8+與治療前差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后觀察組外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD3+CD56+、CD4+/CD8+與對照組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組治療前后T細胞亞群水平比較

組別例數(shù)CD3+(%)治療前治療后CD4+(%)治療前治療后CD8+(%)治療前治療后對照組2668.39±6.5168.39±6.5137.36±6.3737.36±6.3726.72±6.4526.72±6.45觀察組3061.45±6.7865.94±8.37*31.89±7.5636.32±9.31*27.98±8.7326.56±4.67t3.8911.2082.9020.4800.6060.107P0.0000.2320.0050.6330.5470.915組別例數(shù)CD3+CD56+(%)治療前治療后CD4+/CD8+治療前治療后對照組269.14±2.789.14±2.781.53±0.451.53±0.45觀察組306.34±2.568.57±2.65*1.08±0.561.24±0.73t3.9220.7853.2801.756P0.0000.4360.0020.085

*P<0.05與治療前比較(配對t檢驗)

2.2 2組治療前后細胞因子水平比較 治療前觀察組外周血中IL-2、IFN-γ低于對照組，IL-4高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后觀察組外周血中IL-2、IFN-γ高于治療前，但低于對照組，IL-4低于治療前，但高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療前后2組IL-10差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 觀察組治療前后肝、腎功能及甲胎蛋白水平比較 觀察組肝、腎功能指標治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；甲胎蛋白水平較治療前明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 2組治療前后細胞因子水平比較

組別例數(shù)IL-2治療前治療后IL-4治療前治療后對照組2613.67±2.8713.67±2.875.68±2.045.68±2.04觀察組308.23±3.7811.87±1.35*7.51±1.656.56±1.13*t5.9903.0693.7102.032P0.0000.0030.0010.047組別例數(shù)IFN-γ治療前治療后IL-10治療前治療后對照組2612.56±2.3412.56±2.348.56±1.128.56±1.12觀察組307.97±2.8910.67±4.05*8.97±1.348.24±0.54t6.4652.0941.2311.391P0.0000.0410.2240.170

*P<0.05與治療前比較(配對t檢驗)

表3 觀察組治療前后肝、腎功能及甲胎蛋白水平比較

檢測時間丙氨酸轉氨酶(U/L)天冬氨酸轉氨酶(U/L)尿素氮(μmol/L)肌苷(μmol/L)甲胎蛋白(μg/L)治療前69.51±31.5657.67±30.235.17±1.6873.10±16.85502.34±45.71治療后39.50±29.3238.34±27.875.23±2.3272.16±21.67466.43±47.31t1.9781.9090.1150.1882.990P0.0530.0610.9090.8520.004

2.4 不良反應觀察 多數(shù)患者安全無不良反應，3例患者細胞回輸后6 h內出現(xiàn)體溫升高，但均未超過38 ℃，無明顯寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐等不適，給予臨床觀察，適量飲水休息后體溫逐漸恢復正常。1例體溫超過38 ℃，給予退熱藥物治療后體溫恢復正常。余患者均未出現(xiàn)嚴重不良反應。

2.5 生活質量評價 生活質量提高者19例，穩(wěn)定者6例，下降者5例，總提高率為63.3%(19/30)；患者乏力、食欲不振、周身不適、精神狀態(tài)等臨床癥狀明顯改善；疼痛評分無明顯改善，治療前有6例患者出現(xiàn)輕-中度疼痛(疼痛評分3～5分)，治療后仍未見明顯緩解。

2.6 生存期和腫瘤進展 3個月、6個月隨訪無1例患者死亡。1年隨訪時有1例患者因消化道出血死亡。1例患者出現(xiàn)肝外轉移，3例患者出現(xiàn)肝內轉移，其中3例因并發(fā)肝腎綜合征及肝衰竭死亡，目前1例尚生存。共4例患者死亡。1年生存率為86.7%(26/30)。

3 討 論

原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿，一旦臨床診斷，多處于中晚期，因此有效安全的綜合治療是延緩疾病進展、延長患者生存期的重要策略[5]。生物免疫治療現(xiàn)已成為腫瘤治療的一種主要手段，近幾年開展的生物免疫治療已經廣泛用于腫瘤術后以及與放化療結合，對于減少腫瘤的術后復發(fā)、提高患者的免疫功能均已顯示出其獨特作用。DC、DIK共同培養(yǎng)后繁殖速度明顯增快，細胞活性強大，具有明顯的協(xié)同抗腫瘤作用，殺瘤譜廣，可選擇性地殺傷腫瘤細胞，并且對正常細胞沒有毒性作用，臨床應用時細胞毒性較小及不良反應輕微，僅發(fā)現(xiàn)有發(fā)熱、乏力等類似流感樣的不良反應，機體免疫力明顯提高，激活機體全身性抗癌效應，對原發(fā)性腫瘤、轉移性腫瘤均有一定療效。DC其未成熟時遷徙能力強大，成熟后可以激活T淋巴細胞，為目前機體內最強大的抗原遞呈細胞，可以有效地攝取、加工、遞呈抗原，參與機體免疫應答過程。CIK抗腫瘤作用機制如下：①自然殺傷作用，CIK的胞質顆?？梢灾苯哟┩改[瘤細胞膜，裂解其腫瘤細胞；②CIK可以增強T淋巴細胞的功能，進而進一步激活機體的免疫功能[6]；③CIK還可以活化白細胞介素等多種抗腫瘤細胞的因子[7]。CIK具有非限制性細胞毒性作用，可以強而有效地分解腫瘤細胞。近年來隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，肝癌患者總體治療效果有了顯著性提高，但術后復發(fā)與合并失代償性肝硬化等問題仍嚴重影響著患者的預后[8]。研究證明抗腫瘤免疫與患者預后關系密切[9]。加強全身抗腫瘤免疫反應可降低肝癌治療后腫瘤復發(fā)，改善患者的預后[10]。

肝癌患者大多自身免疫系統(tǒng)嚴重失衡，存在細胞免疫抑制現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為CD3+、CD4+、CD4+/CD8+細胞水平降低，CD8+細胞水平升高，符合腫瘤的免疫逃避機制[11]。本研究結果與之相符，說明腫瘤細胞本身可以分泌免疫抑制物質，降低機體對其的應答效應，從而有利于腫瘤細胞生長和遷移。CIK是患者外周血單個核細胞體外經過多種細胞因子的共同誘導而獲取的一群以CD3+、CD8+和CD3+、CD56+為主的異質細胞群，其具有T淋巴細胞的強大抗瘤活性以及自然殺傷細胞非限制性殺瘤作用，在體內外繁殖能力強，是一種殺瘤活性和殺瘤譜更強大的新型抗腫瘤效應細胞。DC、CIK共培養(yǎng)后，CIK中CD3+、CD8+、CD3+/CD56+比例明顯增高，說明大量成熟DC促進CIK的成熟。本研究進一步分析其對T細胞亞群的影響，結果發(fā)現(xiàn)治療后患者外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+細胞比率顯著高于治療前(P<0.05)，CD4+/CD8+比值(有升高趨勢)、CD8+與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？梢奃C-CIK免疫治療后，患者自身的免疫功能具有一定的升高趨勢，但其免疫狀態(tài)仍然處于低水平。DC-CIK免疫治療在有效抵抗腫瘤的同時，能有效地刺激T細胞亞群的繁殖，加強機體的免疫功能，更加有效發(fā)揮CIK的殺瘤作用。

近幾年研究表明，IFN-γ、IL-2屬于Th1類細胞，特點是增強機體本身細胞免疫功能，IL-4、IL-10屬于Th2類細胞，特點是參與機體的體液免疫[12]。Th1類細胞有較強的腫瘤殺傷作用[13]，而Th2類細胞在大多數(shù)惡性腫瘤患者體內比例明顯升高，免疫失衡狀態(tài)較為嚴重。Th1/Th2免疫失衡與腫瘤免疫的關系密切相關[14]，正常情況下Th1/Th2處于相對平衡狀態(tài)，當Th2類細胞因子高表達、Th1類細胞因子低表達時，促進腫瘤進展。本研究結果顯示，治療后患者IFN-γ水平較治療前上升，而IL-4水平下降(P<0.05)。表明DC-CIK治療可以糾正Th1/Th2免疫失衡，提高患者免疫功能，提示機體免疫功能向Th1方向發(fā)展，有利于更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。

DC-CIK免疫治療取得了良好的臨床療效，與治療有關的嚴重不良反應未見報道，但一些輕微的不良反應卻時有報道，需引起重視。本研究中有4例患者出現(xiàn)不同程度發(fā)熱，但體溫一般不會超過38 ℃，持續(xù)2～6 h，休息、飲水后體溫可自行恢復正常?？赡芘c大量細胞進入體內，刺激分泌大量細胞因子，機體免疫狀態(tài)失衡有關，需要一段時間才能重新恢復平衡，過程中可能會出現(xiàn)發(fā)熱、乏力等的現(xiàn)象，均為正常反應。

綜上所述，DC-CIK免疫療法，作為惡性腫瘤的一種輔助治療方法，其不良反應較輕微，患者治療過程中的耐受性好，大大提高了患者“帶瘤生存”的生活質量，改善其臨床癥狀。但是目前CIK的抗腫瘤作用機制、影響DC-CIK增殖的因素、體內分布情況及確切臨床療效的評價等問題仍有待于進一步研究。如何解決腫瘤患者體內免疫抑制的狀態(tài)，使DC-CIK發(fā)揮更好的抗腫瘤作用也需要臨床工作者深入探討。

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2015-12-04；

2015-12-28

河北省醫(yī)學科學研究重點課題(ZD20140346)

賈蓓(1980-)，女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事肝臟疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：ljn790527@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.017

R735.7

B

1007-3205(2016)04-0440-05

趙麗潔)