2-甲氧基雌二醇對小鼠惡性黑色素瘤B16細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

胡彩霞，馮 佳，呂麗景，高順強，王文氫 ，張國強*

(1.河北醫科大學第四醫院皮膚科, 河北 石家莊 050011;2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院消化內科，河北 石家莊 050082)

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·論 著·

2-甲氧基雌二醇對小鼠惡性黑色素瘤B16細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

胡彩霞1，馮 佳2，呂麗景1，高順強1，王文氫1，張國強1*

(1.河北醫科大學第四醫院皮膚科, 河北 石家莊 050011;2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院消化內科，河北 石家莊 050082)

目的探討2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2-ME)對惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM) B16細胞增殖、侵襲及遷移的影響。方法將體外培養的小鼠MM B16細胞用不同濃度(10、20、40 μmol/L)的2-ME處理。未經任何處理的小鼠MM B16 細胞，記作B16-negative。倒置顯微鏡下觀察細胞形態，平板克隆形成實驗檢測2-ME處理小鼠MM B16細胞2周后的克隆形成能力。Transwell方法觀察藥物在體外對細胞趨化侵襲能力的影響。觀察藥物在體外對細胞遷移能力的影響。細胞劃痕實驗觀察經10 μmol/L 2-ME處理MM B16細胞24 h后劃痕愈合程度。結果與對照組比較，不同濃度的2-ME處理MM B16細胞后克隆形成率差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，2-ME組細胞侵襲能力及遷移能力差異均有統計學意義(P<0.05)。劃痕實驗證實對照組的MM B16細胞經過24 h后幾乎遷移至所有的劃痕區域，而實驗組MM B16-10 μmol/L的劃痕區域僅有部分由MM B16 細胞占有。結論 2-ME對小鼠MM B16細胞的增殖具有抑制作用，能夠抑制MM B16細胞的克隆形成能力。2-ME可以抑制小鼠MM B16細胞的侵襲和遷移運動能力。

黑色素瘤；雌二醇；腫瘤浸潤；小鼠

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是由神經鞘細胞惡變異常增殖形成的。其源自于調控重要細胞功能基因的激活與失活，包括調控細胞周期、生存、血管生成、細胞遷移及擴散等[1]。有研究表明，黑素瘤自發凋亡水平較低，可能是導致其發展迅速、容易轉移的眾多因素之一[2]。這也使得深入研究黑素瘤發生侵襲遷移的機制、探索新藥物及新的治療方案顯得尤為重要。2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2-ME)為內源性17β-雌二醇的體內代謝產物，眾多研究者發現2-ME可以抑制多種腫瘤細胞的活性，包括神經膠質瘤、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、宮頸癌、卵巢癌以及造血系統腫瘤等[3]。本研究旨在探討在體外2-ME對小鼠MM B16細胞的增殖、侵襲以及遷移能力的影響，報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 小鼠MM B16細胞由河北醫科大學第四醫院科研中心惠贈。2-ME購自美國Cayman公司，RPMI-1640培養基購自美國GIBCOL公司，四甲基偶氮唑藍購自上海永葉生物科技有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司，Transwell小室(直徑8 μm)購自美國Costar公司。

1.2 細胞培養 MM B16細胞使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(含濃度為10×104U/L青霉素、10×104μg/L鏈霉素，pH 7.3)于5%CO2、37 ℃飽和濕度培養箱常規培養。倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組設計 取對數生長期的小鼠MM B16細胞隨機分組。實驗組：用不同濃度的2-ME處理小鼠MM B16細胞，使其終濃度分別為10 、20 、40 μmol/L，分別記作B16-10 μmol/L、B16-20μmol/L、B16-40μmol/L。陰性對照組：未經任何處理的小鼠MM B16 細胞，記作B16-negative。

1.3.2 平板克隆形成實驗檢測細胞的克隆形成能力 取出對數生長期的細胞，完成細胞重懸液的制備。計數細胞，將細胞濃度稀釋為5×106/L。 將稀釋好的細胞懸液分別接種入無菌細胞培養皿內，每皿100 μL細胞懸液，當細胞完全貼壁時，進行隨機分組，將已配置好的含各個藥物濃度的培養基加入培養皿中，對照組加入等體積的培養基，培養 2周，待細胞長出肉眼可見的細胞克隆時即中止培養。進行細胞染色并細胞克隆計數：細胞克隆形成率按下公式計算，克隆形成率 = 克隆形成數/接種細胞數(500)×100%。

1.3.3 Transwell法檢測細胞的侵襲情況 將Matrigel 膠融化，按體積比為1∶8與RPMI-1640培養基混合，以每孔 50 μL 加入到小室的上室面，將小室放入24孔板內，置于37 ℃孵箱內 6 h，使膠凝固。每組細胞制備4個小室，共制備16個小室。用無血清RPMI-1640培養基將細胞稀釋成1×109/L的細胞懸液。水化基質膜后，對照組加入10 μL的培養基，實驗組分別加入10 μL的濃度為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的2-ME，每組復3孔，并做好標記，將 24 孔板放入孵箱內繼續培養24 h。進行細胞染色，顯微鏡下細胞計數。

1.3.4 Transwell法檢測細胞的遷移情況 實驗步驟基本同上述的Transwell 細胞侵襲實驗，區別為：①無需包被Matrigel膠，在小室內直接接種細胞；②稀釋細胞時將細胞懸液稀釋至5×108/L，每孔加入 200 μL細胞懸液，即每孔接種細胞數為1×105個；③下室面加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基；④培養 8 h 后進行細胞Giemsa染色，在顯微鏡下每膜計數5個視野進行計數，計算平均值。

1.3.5 細胞劃痕實驗 選取處于對數生長期的MM B16細胞，制備細胞懸液，接種細胞于 12孔細胞培養板中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養 24 h。人工劃痕：在細胞密集處用移液器槍頭做一字劃痕，造成培養細胞切口模型，置于顯微鏡下觀察，記錄劃痕寬度。按實驗設計進行隨機分組，實驗組加入含10 μmol/L 2-ME的培養液常規培養，對照組只加入等體積的培養液。于24 h后倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，記錄 0 h及 24 h細胞向劃痕方向的移動情況并拍照記錄。

2 結 果

2.1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態 經2-ME處理48h后，實驗組(B16-10μmol/L、B16-20μmol/L、B16-40μmol/L)細胞貼壁能力均呈現下降趨勢，可見漂浮狀細胞，部分細胞變圓，B16-negative組部分細胞聚集成片狀，貼壁生長良好，數量增多，大部分呈多角形，可見偽足，細胞漿液均勻飽滿，具有良好的折光性(圖1)。

圖1 不同濃度的2-ME作用48 h后對小鼠MM B16細胞的形態學影響(×200)

A.陰性對照組細胞形態；B.10 μmol/L 2-ME組細胞形態；C.20 μmol/L 2-ME組細胞形態；D.40 μmol/L 2-ME組細胞形態

Figure 1 Cellular morphology analysis of MM B16 melanoma cells treated with 2-ME at different concentrations for 48 hours( ×200)

2.2 各組細胞克隆、侵襲力和穿模細胞數比較 應用平板克隆形成實驗，以不同濃度(10、20、40 μmol/L)的2-ME干預MM B16 2周，觀察各組細胞克隆形成數，結果顯示隨著2-ME濃度的升高，各組克隆形成率逐漸降低(圖2)； 應用Transwell 法檢測細胞侵襲能力，經不同濃度(10、20、40 μmol/L)的2-ME干預24 h后，于顯微鏡下觀察可見實驗組細胞數目均少于對照組；應用Transwell 法檢測細胞遷移能力，結果顯示不同濃度(10、20、40 μmol/L)的2-ME干預8 h后，于顯微鏡下觀察可見實驗組細胞數目均少于對照組。 各組克隆形成率、穿Matrigel膠細胞數和穿膜細胞數比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組克隆形成率、穿Matrigel膠細胞數和穿膜細胞數比較

Table 1 The cloning efficiency,the numbers of invasive melanoma cells and migratory melanoma cells in different groups

組別 克隆形成率(%)穿Matrigel膠細胞數(個)穿膜細胞數(個)對照組 60.6±3.175.0±5.689.8±5.1B16-10μmol/L32.5±1.8*51.0±4.3*72.6±5.6*B16-20μmol/L19.0±2.3*#38.8±4.2*#54.4±9.2*#B16-40μmol/L13.5±1.9*#△20.2±4.8*#△32.8±6.0*#△F 238.794115.48067.227P 0.0000.0000.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與B16-10 μmol/L組比較 △P<0.05與B16-20 μmol/L組比較(q檢驗)

圖2 2-ME作用不同濃度的MM B16細胞2周后對其克隆能力的影響

A.陰性對照組；B.10 μmol/L 2-ME組；C.20 μmol/L 2-ME組；D.40 μmol/L 2-ME組

Figure 2 Effects of 2-ME on the colony capacity of MM B16 melanoma cells treated with 2-ME at different concentrations for 2 weeks

2.3 細胞劃痕實驗結果 劃痕實驗證實陰性對照組的MM B16細胞經過24 h后幾乎遷移至所有的劃痕區域，而10 μmol/L實驗組的劃痕區域僅有部分由MM B16 細胞占有(圖3)。

圖3 10 μmol/L 2-ME作用MM B16細胞24 h后對其遷移能力的影響

A.對照組0 h；B.對照組24 h；C.實驗組0 h；D.實驗組24 h

Figure 3 Effects of 2-ME on the migration capacity of MM B16 melanoma cells treated with 2-ME at 10 μmol/L

3 討 論

惡性腫瘤發生、發展、形成是多種因素共同作用的結果，造成調節和控制細胞生長、增殖的功能發生嚴重紊亂，從而導致細胞無限制增長，目前各種調控細胞功能的癌基因和抑癌基因與惡性腫瘤發生發展的關系越來越受到人們的關注[4]。惡性腫瘤特殊表現除腫瘤細胞的無限制生長以外，還包括其對周圍正常組織的直接侵襲，以及通過血液，淋巴液等向遠處組織的轉移。因此，抑制腫瘤細胞無限制的增殖、侵襲和轉移是治療腫瘤的有效方法。MM惡性度高，生長較快，極易在疾病早期發生轉移，其預后極差，病死率較高。近幾十年中，MM的發病率呈逐漸增加趨勢，美國國家癌癥研究所估計2015年美國大約有73 870例新發的MM病例(其中女性42 670例，男性31 200例)[5]。目前治療MM的主要方法仍然是外科手術切除，但有研究指出術后仍可在局部或遠處發生復發和轉移[6]。現今達卡巴嗪成為治療轉移性MM主要藥物[7]，但MM對放化療的不敏感性使其預后更差。有研究表明，目前常用的治療MM藥物(如順鉑、紫杉醇、卡鉑、替莫唑胺、達卡巴嗪等)無法進一步提高患者的生存率，且藥物治療會對人體產生嚴重的不良反應[8-9]。目前尚無特效抗MM藥物，因此尋求新型的抗MM藥物是必然趨勢。

2-ME是內源性雌激素代謝物，具有多種抗腫瘤活性作用。目前，已將2-ME單獨或聯合其他化療藥物如硼替佐米、索拉非尼用于多發性骨髓瘤、肝細胞癌等多種腫瘤細胞株的實驗研究[10-11]。其具體作用機制包括抑制多種腫瘤滋養血管的生成、延緩腫瘤細胞復制周期，甚至造成腫瘤細胞復制停滯以及誘導腫瘤細胞凋亡等，而這些作用并不是通過與雌激素受體結合產生的[12]，故2-ME并不會產生雌激素的不良反應，安全性相對較高。本研究從基礎實驗來探討2-ME對小鼠MM B16細胞的增殖、侵襲和轉移的影響，旨在為2-ME用于臨床治療MM提供基礎理論依據。

MM細胞的無限增殖是其特點之一，平板克隆形成實驗是檢測單個細胞增殖能力的較為常見的實驗。本研究結果顯示，在3個實驗組中給藥濃度越高其集落形成越少，對照組、B16-10 μmol/L組、B16-20 μmol/L組和B16-40 μmol/L組克隆形成率分別為(60.6±3.1)%、(32.5±1.8)%、(19.0±2.3)%、(13.5±1.9)%。表明隨著給藥濃度的增加，2-ME抑制小鼠MM B16細胞克隆能力越明顯，可見2-ME對MM B16細胞的增殖具有抑制作用，其結果與前期實驗中SRB法檢測2-ME對小鼠MM B16細胞的增殖具有抑制作用的結果相一致[13]，兩者結合更進一步證實了2-ME對小鼠MM B16細胞的增殖具有抑制作用。

侵襲和轉移是惡性腫瘤的標志，是其致死的主因。腫瘤的侵襲轉移是一個連續、漸進的多步驟動態過程，包括黏附、運動、增殖、基質降解以及新生血管形成等多步驟信號級聯反應[14]。本研究中的Transwell侵襲實驗是觀察小鼠MM B16細胞在趨化劑誘導下穿過多孔濾膜的情況，它是測定細胞侵襲能力的經典模型，已被廣泛應用于探討癌細胞侵襲的相關研究中。結果可以看出10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的2-ME均能抑制小鼠MM B16細胞的侵襲能力，且隨著濃度的增加，抑制侵襲能力的作用越顯著。同樣，通過Transwell遷移實驗可以看出2-ME能夠抑制鼠黑色素瘤B16細胞的遷移運動能力，隨著各組之間藥物濃度的增加，抑制此腫瘤的遷移能力的作用也越來越顯著。細胞劃痕實驗是模擬體內傷痕康復模型，可觀察細胞遷移的情況，是測定細胞遷移能力的經典方法。本研究結果顯示2-ME可以抑制小鼠MM B16細胞的遷移能力，與經Transwell遷移實驗所得結果相一致。細胞劃痕實驗與Transwell遷移實驗共同證實2-ME可以抑制MM B16細胞的遷移運動能力。

總之，MM是惡性度極高的腫瘤，極易發生侵襲與轉移。其發生、發展、形成是多種因素參與作用的共同結果。從目前治療現狀來看，治療MM的關鍵是早發現早治療。對2-ME作用于MM的研究并不多見，通過平板克隆實驗提示2-ME可能對MM增殖產生抑制作用，通過Transwell 侵襲遷移實驗和細胞劃痕實驗研究發現2-ME可以抑制腫瘤的侵襲和遷移，但這只是體外實驗的一部分，其詳細作用機制需進行相關基因的體內外實驗進一步探討。

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Effects of 2-Methoxyestradiol on growth, invasion and migration of malignant melanoma B16cells

HU Cai-xia1, FENG Jia2, LV Li-jing1, GAO Shun-qiang1,WANG Wen-qing1, ZHANG Guo-qiang1*

(1.Department of Dermatology, the Forth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China；2.Department of Gastroenterology, the Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, China)

Objective To observe the effects of 2-methoxyestradiol(2-ME ) on proliferation, invasion, migration of malignant melanoma(MM) B16 cells. Methods MM B16 cells cultured in vitro were regarded as the control group. MM B16 cells were treated with different concentrations of 2-ME(10, 20, 40 μmol/L). MM B16 cells were recorded in MM B16-negative cells without any treatment. Morphological changes of MM B16 cells were observed by inverted microscope after 48 h. The plate colony assay was used to testify the colony-formation ability of MM B16 cells treated with 2-methoxyestradiol for 2 weeks. The transwell assay was used to detect the capacity of invasion and migration of MM B16 cells treated with 2-methoxyestradiol in different concentrations. The wound healing assay was used to testify the capacity of migration of MM B16 cells treated with 2-ME at the concentrations of 10 μmol/L for 24 h. Results Compared with the control group the colony-formation ability of MM B16 cells treated with 2-ME was significantly inhibited(P<0.05). The capacity of invasion and migration of MM B16 cells treated with 2-ME was inhibited compared with the control group(P<0.05). The cells in the control group almost migrated to all the scratches. Only some scratches areas were occupied by cells in the 10 μmol/L experimental group. Conclusion 2-ME could inhibit the proliferation of MM B16 cell in a time-dose-dependent manner. 2-ME could inhibit the cloning ability of MM B16 cell. 2-ME could inhibit the capacity of invasion and migration of MM B16 cell.

melanoma； estradiol; neoplasm invasiveness; mice

2015-07-02；

2015-07-23

河北省醫學科學研究重點課題(20130252)

胡彩霞(1982-)，女，河北衡水人，河北醫科大學第四醫院主治醫師，醫學碩士，從事皮膚病診治及激光美容研究。

*通訊作者。E-mail:zgq810328@sina.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.010

R739.5

A

1007-3205(2016)04-0407-05

許卓文)