大鼠下頜持續前導后髁突軟骨骨形態發生蛋白-2的表達*

秦　波, 潤　丹， 徐衛華

(貴州醫科大學附屬口腔醫院 正畸科， 貴州 貴陽　550004)

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大鼠下頜持續前導后髁突軟骨骨形態發生蛋白-2的表達*

秦波, 潤丹， 徐衛華*

(貴州醫科大學附屬口腔醫院 正畸科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討大鼠下頜持續功能前導后髁突軟骨各部位骨形態發生蛋白-2(BMP-2)的表達。方法： 40只35 d齡雄性SD大鼠均分為實驗組和對照組，實驗組大鼠24 h戴自制功能性矯治器引導下頜前伸，對照組不做處理；于實驗后第3、7、14及28天時處死大鼠，采用免疫組化方法觀察髁突軟骨前、中、后各部位骨組織中BMP-2的表達。結果： 隨著觀測時間點后移，對照組中髁突軟骨前、中、后部的BMP-2陽性細胞數逐漸減少，實驗組BMP-2陽性細胞數逐漸增加，差異無統計學意義(P>0.05)；各時點同組大鼠髁突軟骨后部BMP-2表達陽性細胞數高于中部和前部(P<0.05)；從第7天起，實驗組BMP-2表達陽性細胞數高于同時間點同部位對照組，差異有統計學意義(P<0.05、0.01)。結論： BMP-2可能參與了下頜骨髁狀突骨改建過程；但對不同部位軟骨的改建可能不同。

[關鍵詞]髁突軟骨； 下頜前導； 骨形態發生蛋白-2； 免疫組化； 大鼠，Sprague Dawley

髁突的生長改建直接影響下頜的形態和功能，髁突軟骨與關節盤直接接觸，其改建直接反映了外力對髁突的影響。。骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)能夠誘導人或動物間充質細胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經組織, 是骨組織形成過程中最為關鍵的調節因子。在結構正常的組織中，BMP-2處于較低水平；在創傷、機械力刺激的情況下， BMP-2濃度增高，參與促進間充質細胞向成軟骨細胞及骨細胞轉化。吳拓江等研究表明髁突軟骨BMP-2的表達強弱與機械應力大小有關，髁突軟骨中BMP-2來自成骨細胞、軟骨細胞和間充質細胞，通過檢測軟骨中BMP-2的表達可以反映成骨的活躍程度。本研究通過模擬臨床功能矯治器，建立大鼠下頜持續前導的動物模型，造模后檢測不同時間點大鼠髁突軟骨前、中和后部骨組織中BMP-2的表達，探討BMP-2對髁突不同部位軟骨骨改建的影響。

1材料與方法

1.1動物與材料

選擇健康雄性35 日齡 SD大鼠(貴州醫科大學動物實驗中心提供)40只，隨機均分為實驗組和對照組。骨形態發生蛋白2抗體 (武漢博士德生物工程有限公司)，增強型(Polink-1)檢測試劑盒、PV-6001 兔兩步法檢測試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)及濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2方法

按照參考文獻制作大鼠咬合前導裝置，實驗組模擬臨床功能矯治器引導下頜前伸。對照組不做處理，所有動物自由飲水、飲食，同環境下飼養直至實驗結束。分別于實驗后第3、7、14及28天時，給予0.3%戊巴比妥鈉10 mL/g劑量腹腔注射全麻下處死大鼠，5只/組，分離組織，整塊取下髁狀突。10%福爾馬林溶液固定24 h，EDTA液脫鈣4周，常規脫水，石蠟包埋。石蠟縱向切片，脫水 ，抗原修復，去離子水孵育10 min(阻斷內源性過氧化物酶)，PBS液洗3次，3 min/次，加一抗后 4 ℃過夜，次日，PBS液洗3次，2 min/次，加入兔IgG抗體-HRP多聚體工作液37 ℃孵育 30 min ，PBS液洗3次，2 min/次，DAB顯色，ddH2O終止顯色，蘇木素染色處理30 s，ddH2O沖洗，酸酒精處理10 s，氨酒精脫水透明1 min，樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，大鼠氣管軟骨組織作為陽性對照，細胞胞漿顯示特異黃色或棕黃色為染色陽性。在光學顯微鏡下應用Pixera PVC100C系統采圖，Photoshop 8.0軟件分別選取髁突軟骨前、中、后部進行觀測，每部分選擇連續3個100 px×100 px區域，計數各區域棕色深染的陽性細胞數。

1.3統計學處理

2結果

隨著觀測時間點后移，對照組中髁突軟骨前、中、后部的BMP-2表達陽性細胞數逐漸減少，實驗組逐漸增加，但差異無統計學意義(P>0.05)；同組內，大鼠髁突軟骨后部BMP-2表達陽性細胞數高于中部和前部(P<0.05)；從第7天起，實驗組BMP-2表達陽性細胞數高于同時間點同部位對照組，差異有統計學意義(P<0.05、0.01)。見表1。

表1　大鼠下頜持續前導后髁突軟骨各部位及不同時間BMP-2陽性細胞數±s)

(1)與同組內后部比較，P<0.05；與對照組同時點同部位比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01

3討論

髁突具有較強的生長改建能力，是整個下頜骨生長發育的中心。髁突軟骨位于髁突表面，是一種特殊形式的結締組織，不含血管、淋巴管及神經纖維。髁突軟骨是直接接觸關節盤的部位，因而其改建直接反映了外力對髁突的影響。覆蓋于下頜髁突關節表面的纖維軟骨，是髁突改建能力的基礎，研究表明顳頜關節具有終生改建能力, 尤其是在幼年期及青少年改建能力較強。髁突的改建易受環境因素影響，張紅梅等通過升高后牙咬合，增加了垂直向的距離，改變了下頜的位置，從而改變了髁突的位置及負荷，髁突進行了適應性改建。髁突的生長過程即為軟骨細胞不斷分化成熟的軟骨內骨化過程，BMP-2在軟骨細胞分化過程中起著重要的誘導作用。有研究報道在小鼠ATDC 5細胞系中，BMP-2可以通過誘導細胞跳躍早期細胞的聚集階段而直接促進軟骨的形成。體內外實驗研究都已證實BMP-2可以誘導軟骨細胞的增殖和分化，促進軟骨細胞胞外基質的合成和維持。

在本研究中，實驗組大鼠下頜后髁突軟骨BMP-2的表達在第7、14、28天強于對照組，特別是在增殖層，同時在初期伴有該層的增厚，提示BMP-2在促進未分化的細胞向前軟骨細胞的分化過程中起著重要作用，大量的未分化細胞分化成前軟骨細胞，從而為軟骨成熟提供足夠的細胞來源；同時BMP-2在過渡層和肥大層表達的增強說明下頜前導加快了軟骨細胞成熟，促進了髁突軟骨的增生，提示BMP-2可能參與了下頜骨髁狀突骨改建過程。實驗組BMP-2表達第28天時較第14天時減少可能是局部組織改建已逐漸適應了外界力的刺激所致。趙志河等的研究結果顯示髁突軟骨表面的前部為壓應力集中區，后上部則為張力區，髁突發生向前向下的位移，認為前伸下頜能促進下頜髁突的生長，與本實驗結果相符。本研究實驗組在同一時間點BMP-2表達在髁突后部要強于前部和中部，提示BMP-2的表達可能與下頜前導后髁突不同部位所產生的應力不同有關。綜上，BMP-2可能參與了下頜骨髁狀突骨改建過程，但對不同部位軟骨的改建可能不同。

4參考文獻

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(2016-02-15收稿，2016-04-07修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

The Expression of BMP-2 in the Condyle of Rat during Mandibular Advancement

QIN Bo, RUN Dan, XU Weihua

(DepartmentofOrthodontics,TheAffiliatedStomatologyHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang, 550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the expression of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in the condylar cartilage of rats during mandibular advancement. Method: Forty 35-day-old male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into experimental group and control group. In experimental group the rats were treated with self-made functional appliance which caused mandibular protrusion while in control group the rats received no treatment. 5 rats in each group were sacrificed on the day 3, 7, 14 and 28 after experiment respectively. The expressions of BMP-2 in anterior, middle and posterior region of condyle cartilage were examined by immunohistochemical staining. Results: With the observation time extended, the number of BMP-2 expression positive cells in anterior, middle and posterior region of condyle cartilage in control group decreased gradually while the number of BMP-2 positive cells increased gradually, but the differences between two groups were not statistically significant(P>0.05). At different time points, the number of BMP-2 expression positive cells in posterior region was higher than that of anterior or middle region in experimental group (P<0.05). From 7th day, at the same time point, the number of BMP-2 expression positive cells in experiment group was significantly higher than that of control group (P<0.05).Conclusions: BMP-2 may participate in the remodeling activities of condylar cartilage. Its effect on mandibular cartilage remodeling may be different in different region of condyle cartilage.

[Key words]condyle cartilage; mandibular advancement; bone morphogenetic protein 2; immunohistochemical staining; rats, Sprague-Dawley

*通信作者E-mail:29574748@qq.com

[中圖分類號]R783.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0570-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.019

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2013.004.html