丹參酮Ⅱ-A對大鼠成骨細胞BMP-2表達的影響*

莫朝倫， 張軍梅**， 賈　瑩， 王藪馨， 楊夏晴， 馮安琪

(1.貴州醫科大學 口腔醫學院 口腔正畸學教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴陽市口腔醫院， 貴州 貴陽　550004)

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丹參酮Ⅱ-A對大鼠成骨細胞BMP-2表達的影響*

莫朝倫1， 張軍梅1**， 賈瑩1， 王藪馨1， 楊夏晴2， 馮安琪1

(1.貴州醫科大學 口腔醫學院 口腔正畸學教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽市口腔醫院， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察丹參酮Ⅱ-A(TsⅡ-A)對大鼠大鼠成骨細胞(OB)中骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA 表達的影響。方法: 培養原代大鼠OB并傳代接種后采用Cell Counting Kit-8試劑盒比色法檢測5×10-3、5×10-2以及5×10-1mg/L 3個濃度的TsⅡ-A(統稱實驗組)和對照組(0 mg/L TsⅡ-A)在第1、3、5、7天對OB的促增殖作用；RT-qPCR 檢測各組OB BMP-2 mRNA 的表達。結果： 不同濃度TsⅡ-A對OB均有促增殖的作用(P<0.05)，其中5×10-2mg/L濃度組促增殖作用最大；在各時間段中，組間比較OB BMP-2 mRNA表達量，實驗組均高于對照組(P<0.05)；各實驗組組內比較，OB BMP-2 mRNA表達趨勢為第7天>第5天>第3天>第1天(P<0.05)。結論： TSⅡ-A在一定的作用時間內可促進OB增殖，并上調OB中BMP-2 mRNA表達水平。

[關鍵詞]丹參酮Ⅱ-A； 成骨細胞； 骨形成蛋白-2； 大鼠，Sprague-Dawley； 信使RNA

丹參屬于經典活血化瘀類中藥,是中醫骨傷科方劑中的常用藥，可促進骨的鈣化，在骨折治療中應用丹參后成骨細胞(osteoblast,OB)在數量及分布部位均明顯增多[1-4]。丹參酮Ⅱ-A(tanshinone Ⅱ-A，TsⅡ-A)屬于丹參的有效活性成分，具有雌激素樣活性、抗菌消炎和促骨代謝等藥理作用[5]。近年來，有學者應用TsⅡ-A于正畸治療的實驗研究中，表明了TsⅡ-A對牙周組織、頜骨改建和調節具有一定的影響作用[6-7]。至今，有關TsⅡ-A對OB增殖分化等方面的研究甚少，其中的相關機制研究不多且不夠深入。本實驗通過體外培養大鼠OB，觀察TsⅡ-A對大鼠OB增殖影響，并采用實時定量PCR(real time PCR)方法，測定TsⅡ-A對大鼠OB骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)mRNA表達的影響，探討TsⅡ-A在OB增殖中可能存在的作用機制,為TsⅡ-A的藥理學作用提供理論參考。

1材料和方法

1.1材料

TsⅡ-A購于Aladdin-阿拉丁試劑(上海)有限公司。新生1～ 2 d SD大鼠乳鼠，體質量7～8 g，清潔級 ,由貴州醫科大學實驗動物中心[SCXK(黔)2012-0001]提供。DMEM高糖培養基(Hyclone，美國)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，青/鏈霉素雙抗(北京索寶萊生物科技有限公司)，0.1%Ⅰ型膠原酶(Gibco，美國)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國)，Cell counting Kit8(CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁)，ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所)，茜素紅指示劑(北京索寶萊生物科技有限公司)。Trizol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen)，引物序列設計及合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，逆轉錄試劑盒(美國Thermo)，熒光mix(瑞士ROCH)。超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，CO2細胞培養箱(MCO-18AIC型，Sanyo，日本)，離心機(HC-2062)，核酸蛋白分析儀(Beckman coulter DU 640型,Beckman，美國)，梯度PCR擴增儀(Eppendorf,美國)，實時熒光定量PCR儀(CFX ConnectTM Real-time System,BIO-Rad,美國)。

1.2方法

1.2.1OB分離、培養及傳代純化取1～2 d SD大鼠6只，取其顱蓋骨于完全培養基中修剪成1 mm3的碎骨片，將碎骨片移至15 mL離心管中，通過2次酶消化法提取原代OB，并于37 ℃、5%的CO2培養箱內進行培養,每2～3 d換液1次，待細胞鋪滿瓶底80%以上后進行傳代并利用差速貼壁法純化OB至第三代[8]。

1.2.2OB增殖情況采用CCK-8試劑盒比色法檢測OB增殖情況。第3代OB以2×104個/mL密度的細胞懸液接種于96孔板(100 μL/孔),各組設4個復孔。依據TsⅡ-A濃度梯度分組(0、5×10-3、5×10-2以及5×10-1mg/L)，0 mg/L TsⅡ-A為對照組，其余濃度為實驗組，設1、3、5、7 d 4個檢測時間點。各孔待測細胞均用CCK-8溶液10 μL孵育2 h后，酶標儀450 nm處讀取OD值。1.2.3BMP-2mRNA表達RT-qPCR法檢測BMP-2mRNA表達。細胞處理：將0和5×10-2mg/L的TsⅡ-A分別處理第三代OB至1、3、5、7 d后，用TRizol試劑提取細胞總RNA。核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度、純度，采用逆轉錄酶和 Oligod(T)18，dNTP將總RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA產物為模板Real-time PCR，采用RT-qPCR Sybr Green法測定，每個樣品設3個復孔，以BMP-2為目的基因，β-actin 為內參照，引物序列設計及合成委托于上海捷瑞生物工程有限公司(表1)。反應體系20 μL，含有cDNA 5 μL，熒光mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL。mRNA擴增條件95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共40個循環。ABI step one plus型熒光定量PCR儀采集待測基因及內參照β-actin擴增各循環熒光信號，以Applied Biosystems SDS 14.0軟件進行熒光采集和數據分析。實時定量PCR結果由熒光定量分析儀自動采集并給出目的基因和參比基因的CT值，用2-ΔΔCT法對基因表達的CT值分析，其中ΔΔCT=ΔCT實驗-ΔCT對照，實驗組及對照組ΔCT=CT目的-CT內參，以目的基因的相對表達量用于統計分析。

表1　RT-qPCR引物序列

1.3 統計學分析

2結果

2.1CCK-8檢測結果

各實驗組TsⅡ-A均可促進OB增殖；5×10-2和5×10-1mg/L濃度組在第1、3、5天對OB的促增殖作用顯著(P<0.05)，其中5×10-2mg/L濃度組促增殖作用最為顯著(P<0.05)；5×10-3mg/L濃度組在第3、5天對OB的促增殖作用顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；各實驗組在第7天時間點對OB的促增殖作用與對照組相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2總RNA鑒定及BMP-2 mRNA表達

所提取的總RNA純度在 1.8～2.0，電泳條帶清晰，28 S∶18 S帶亮度約為2∶1,5 S帶較模糊，無明顯降解，完整性好,見圖1。在各時點實驗組BMP-2 mRNA表達量均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；實驗組各時點BMP-2 mRNA表達趨勢為第7天>第5天>第3天>第1天，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

表2　不同濃度TsⅡ-A對OB增殖的影響(OD值，

(1)與對照組比較，P<0.05

圖1　瓊脂凝膠電泳鑒定總RNAFig.1　Agarose gel electrophoresis of total RNA

(1)實驗組不同時點比較，P<0.05圖2　OB中BMP-2 mRNA的表達Fig.2　Comparison of BMP-2 mRNA expression of osteoblast among groups

(1)不同時間點比較，P<0.05圖3　實驗組OB中BMP-2 mRNA的表達Fig.3　Intro-group comparison of BMP-2 mRNA expression of osteoblast in experiment group

3討論

骨骼具有可塑特性,頜骨是骨骼中可塑性很強的組織，頜骨的可塑性是正畸治療的生物學基礎，其主要體現在破骨與成骨平衡的生理過程，OB是骨塑建的物質基礎，是骨組織更新活動中最重要的功能細胞和效應細胞[9]。OB可通過分泌一些細胞因子參與骨形成過程，同時控制骨基質的礦化過程，其中BMPs是目前比較受關注的與骨誘導有密切關系的一種骨生長因子，表現為誘導成骨作用[10]。其中，BMP-2屬于轉化生長因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β) 超家族成員，是研究和應用最廣泛的生長因子，是促進骨形成和誘導OB分化最重要的細胞外信號分子之一，可上調多種基因表達，并通過與多種細胞因子形成BMP-2 信號通路[11-13]。BMP-2信號通路參與OB分化和骨細胞細胞外基質合成與分泌，促進骨形成，形成骨塑建，維持骨量。

丹參作為中醫常用的活血化瘀類中藥,具有促進骨折愈合、強骨補腎的功效，已被廣泛應用于骨折的實驗研究和治療中，其不僅能改善骨折處血供，還能促使OB數量及分布部位相應增多，促進骨的鈣化。相關研究證明，丹參能夠提高成骨樣細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性，促進OB功能，從而促進新骨形成，丹參還可通過提升破骨細胞(osteoclast，OC)的數量，促進牙槽骨塑建，加快正畸牙的移動等作用[14]。TsⅡ-A是丹參中最為豐富、結構最具有代表性的丹參酮，為丹參的主要脂溶性成分，其不僅具有心血管系統相應藥理作用，還具有雌激素樣活性、抗菌消炎和促骨代謝等藥理作用[5]。相關研究表明，TsⅡ-A在OB-OC共育體系中可明顯提高OB增殖和ALP活性[15]。

本實驗采用CCK-8法檢測在不同濃度TsⅡ-A的作用下對大鼠乳鼠顱蓋骨OB體外增殖的影響，結果顯示，5×10-3、5×10-2和5×10-1mg/L 3個濃度TsⅡ-A均可促進OB增殖，其中5×10-2mg/L濃度組促細胞增殖作用最明顯，提示該藥物濃度為本實驗藥物濃度范圍內相對最佳值，說明適宜濃度TsⅡ-A對體外培養的大鼠乳鼠顱蓋骨OB具有促進細胞增殖作用，這與夏金鑫等[15]研究結果相一致。本實驗檢測5×10-2mg/L濃度TsⅡ-A對OB中BMP-2 mRNA表達的影響，結果顯示，在各檢測時間點BMP-2 mRNA表達量實驗組均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，證明本實驗采用的TsⅡ-A可上調OB中BMP-2 mRNA的表達水平，提示了TsⅡ-A可能存在促進骨形成的作用。各濃度TsⅡ-A組內比較，BMP-2 mRNA表達量隨時間推移呈上升趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)，提示TsⅡ-A可能呈漸進性影響BMP-2 mRNA表達。

綜上所述，本實驗應用的TsⅡ-A對體外培養OB具有一定的促增殖作用，以5×10-2mg/L濃度TsⅡ-A促進作用最為顯著，且在一定的作用時間內，可上調BMP-2 mRNA表達量，其表達量呈時間依賴性。TsⅡ-A可能通過上調BMP-2 mRNA表達水平來促進OB增殖，進而可能影響著正畸矯治中頜骨改建過程。有關TsⅡ-A對OB增殖分化影響的具體作用機制有待進一步研究。

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(2016-01-03收稿，2016-04-30修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

The Expression of BMP-2 mRNA of Rat Osteoblast Cultured with Tanshinone Ⅱ-A

MO Chaolun1, ZHANG Junmei1, JIA Yin1, WANG Souxi1, YANG Xiaqing2, FENG Anqi1

(1.DepartmentofOrthodontics,theSchoolofStomatology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effects of Tanshinone Ⅱ-A on expression of the bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) mRNA of rat osteoblasts. Methods: the original generation of rat osteoblasts were cultivated and passaged, and Tanshinone Ⅱ-A was supplemented into the culture medium of osteoblast at 5×10-3mg/L, 5×10-2mg/L, 5×10-1mg/L respectively．Cell Counting Kit-8 Kit colorimetry were used to detect the proliferation of osteoblast on the 1st, 3rd, 5th, 7thday, the expression of BMP-2 mRNA was checked by RT-qPCR. Results: All concentrations of Tanshinone Ⅱ-A were promoting proliferation of osteoblast (P<0.05), which 5×10-2mg/L demonstrated the greatest effect. The expression of BMP-2 mRNA of experimental group was higher than control group in each period through comparison (P<0.05), while the intra-group comparison displayed that the expression of BMP-2 mRNA showed an increasing trend with time went by(P<0.05). Conclusions: Tanshinone Ⅱ-A promoted the proliferation of osteoblasts in a certain time significantly, and which also could increase the expression level of BMP-2 mRNA .

[Key words]tanshinone Ⅱ-A； osteoblast； bone morphogenetic protein-2; rats，Sprague-Dawley； messenger RNA

*[基金項目]貴陽市科技局基金筑科合同(20151001)

[中圖分類號]R285； R329.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0559-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.016

**通信作者 E-mail:zjm46688@126.com

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2153.054.html