血清循環DNA定量檢測在卵巢癌診斷中的應用價值*

劉麗榮， 文春蓉， 梁　璐， 劉詠梅， 朱麗英

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院 臨床血液學教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴陽市婦幼保健院 檢驗科， 貴州 貴陽　550003)

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血清循環DNA定量檢測在卵巢癌診斷中的應用價值*

劉麗榮1， 文春蓉2， 梁璐2， 劉詠梅1， 朱麗英1

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院 臨床血液學教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽市婦幼保健院 檢驗科， 貴州 貴陽550003)

[摘要]目的： 探討血清循環DNA(cDNA)定量檢測在卵巢癌患者診斷中的應用價值。方法： 以252例經病理證實的上皮性卵巢癌患者為卵巢癌組，100例卵巢良性腫瘤患者作為良性對照組，健康體檢者100例作為健康對照，以微量基因組抽提試劑盒抽提3組患者血清DNA，用實時熒光定量Real-time PCR測定其含量。結果： 良性對照組和健康對照組相比，血清cDNA比值差異無統計學意義(P>0.05)；與良性對照組和健康對照組相比，卵巢癌組血清cDNA Ct值減少，差異有統計學意義(P<0.05)；上皮性卵巢癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期血清cDNA Ct值差異無統計學意義(P>0.05)，但Ⅳ期與Ⅰ期比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論： 定量檢測上皮性卵巢癌患者血清cDNA，有望成為臨床輔助診斷卵巢癌的新手段。

[關鍵詞]血清學； DNA； 卵巢腫瘤； 診斷技術與方法

卵巢癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，發病率占婦科惡性腫瘤的第3位，死亡率占各類婦科惡性腫瘤之首，對婦女生命造成了嚴重威脅。卵巢癌的確診常處于晚期，且大多數初診患者已伴盆、腹腔轉移。目前，卵巢癌的篩查診斷、療效觀察及預后判斷等，仍主要依靠腹腔鏡檢查、組織病理學檢查、血清腫瘤標記物(如CA125、癌胚抗原等)的檢測及影像學檢查，前兩者對卵巢癌的敏感性高，但是具有創傷性，影像學檢查雖無創傷性，但卻容易造成漏診。循環DNA(circulating DNA，cDNA)是一種存在于動植物和人體液中的無細胞狀態的胞外DNA，由細胞受外源性刺激后主動分泌，細胞損傷或死亡后釋放產生[1]。研究表明，外周血cDNA一部分以游離形式存在于血清中，另一部分通過與蛋白質結合成復合體的形式附著在血細胞表面[2]。正常人血液中也存在微量cDNA，某些病理狀態下，cDNA會有不同程度的增高，尤其腫瘤患者血液cDNA濃度明顯高于正常人[3]。目前臨床上關于抽取卵巢癌患者的血清檢測cDNA含量的報道甚少。因此血清cDNA檢測用于卵巢癌的早期診斷具有明顯的優勢和極大的潛力。故本研究通過定量檢測卵巢癌患者血清cDNA水平，以探索檢測血清cDNA水平可否成為用于輔助卵巢癌早期診斷的新方法。

1材料與方法

1.1標本來源

收集2013年7月～2015年2月經臨床病理檢查確診為上皮性卵巢癌患者302例，其中Ⅰ期腫瘤57人，Ⅱ期73人，Ⅲ期94人，Ⅳ期26人；卵巢良性腫瘤患者和健康成年女性各100例血清標本，分別于-80 ℃保存。

1.2方法

1.2.1血清cDNA的提取取600 μL血清標本，用微量基因組DNA抽提試劑盒 (北京天根生物有限公司)，按操作說明書抽提血清DNA，用ELX800酶標儀(Bio-tec，美國)測定各樣品吸光度值(A 260 /A 280)，計算DNA含量和純度。

1.2.2血清DNA Ct值的測定PCR引物參照文獻[4]設計，以看家基因GAPDH為目的基因，引物序列為5′-ATGGTGGTGAAGA-CGCCAGT-3′，5′-GCACCGT-CAAGGCTGAGAAC-3′擴增長度為142 bp，由上海生工生物工程公司公司合成。反應體系含定量PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，DNA模板2 μL，加水補足至25 μL。反應采用兩步法，條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，35個循環。用Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR分析系統進行定量檢測，并作熔解曲線分析，根據各自設定的臨界值的循環數(Ct)值，對cDNA的原始拷貝數進行定量，每個血清 DNA樣品重復測定3次取均值。

1.3統計學處理

2結果

2.1GAPDH基因熔解曲線

熔解曲線顯示GAPDH的擴增反應具有良好的特異性(圖1)，證明實時熒光定量Real-time PCR測定檢測具有高度準確度和可靠性。

圖1　GAPDH基因熔解曲線Fig.1　Melt Curve of gene GAPDH

2.2血清cDNA的Ct值

良性對照組cDNA與健康對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；卵巢癌患者各組與健康對照組、正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；cDNA含量水平隨卵巢癌臨床分期增加呈增高的趨勢，上皮性卵巢癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各組之間差異無統計學意義(P>0.05)，上皮性卵巢癌Ⅳ期組與Ⅰ期組比較， cDNA含量差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3討論

卵巢癌患者的治療療效以及延長生存期的主要關鍵因素取決于早期診斷，因此當今急需建立新的早期檢測手段。近年來隨著腫瘤分子生物學的飛猛發展，人們已初步發現腫瘤患者血清DNA濃度顯著高于正常人群，并提示體液(包括血清、血漿及腹水)DNA中高頻率遺傳學標志變異的檢測對于監控疾病具有一定的臨床意義[5-8]。卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發病率僅次于宮頸癌和宮體癌而列居第3位，約占女性全身惡性腫瘤的4%。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位，對婦女生命造成嚴重威脅，對卵巢癌的早期診斷十分重要。卵巢癌的臨床分期根據1987年國際婦產科聯盟(FIGO)國際分期法可分為如下4期:Ⅰ期，腫瘤局限于卵巢；Ⅱ期，病變累及一側或雙側卵巢，伴盆腔轉移；Ⅲ期，腫瘤侵及一側或雙側卵巢，伴盆腔以外腹膜種植或腹膜后或腹股溝淋巴結轉移;肝臟表面轉移；Ⅳ期，腫瘤侵及一側或雙側卵巢并有遠處轉移，胸水存在時需找到惡性細胞，肝轉移累及肝實質。

表1　各組血清cDNA的Ct值

(1)與健康對照組比較，P<0.05；(2)與良性對照組比較，P<0.05；(3)與上皮性卵巢癌Ⅰ期組比較，P<0.05

cDNA是一種存在于外周血，滑膜液和腦脊液中無細胞狀態的DNA，主要是由單鏈或雙鏈DNA混合組成，以DNA蛋白質復合物或游離DNA兩種形式存在。cDNA的研究分為定性和定量兩種，定性主要檢測血清或血漿中腫瘤特異性基因改變，定量檢測則以血cDNA總量為指標，兩者均可以反應腫瘤的存在及其嚴重程度。對于血cDNA來源有幾種推測:(1)腫瘤細胞的壞死和凋亡釋放大量DNA；(2)循環血或微轉移灶中腫瘤細胞溶解釋放DNA；(3)腫瘤細胞自身向周圍釋放DNA；(4)腫瘤浸潤周圍正常組織細胞、組織變性釋放DNA。

本研究中，利用靈敏度極高的實時熒光定量Real-time PCR技術，定量檢測健康體檢者、卵巢良性腫瘤患者及卵巢癌患者血清cDNA。結果顯示，各期卵巢癌患者血清cDNA均明顯高于健康體檢者和卵巢良性腫瘤患者，提示血清cDNA含量檢測對卵巢癌的診斷具有重要參考價值。對cDNA含量與卵巢癌臨床分期關系的分析顯示，隨著臨床分期的增加，血清cDNA含量逐漸增高，提示卵巢癌各期cDNA含量會顯著增高，但與卵巢癌分期無明顯相關性；Ⅳ期cDNA含量顯著高于前3期，提示卵巢癌晚期cDNA含量會進一步顯著增高。

綜上所述，隨著各種分子生物學技術快速發展和廣泛應用，利用靈敏度極高的實時熒光定量PCR技術，定量檢測卵巢癌患者血清cDNA具有簡單易操作，創傷小等優點，對于手術后的患者無法取組織檢測化驗，可助其實時監測手段。作為一種微創而便捷的輔助手段，在卵巢癌的早期診斷、臨床分期、療效評估和預后判斷等方面具有較高的應用價值。

4參考文獻

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(2016-01-12收稿，2016-04-25修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Clinical Application Value of Quantitative Detection of Serum Circulating DNA in Diagnosis of Ovarian Cancer

LIU Lirong1， WEN Chunrong2， LIANG Lu2， LIU Yongmei1， ZHU Liying1

(1.DepartmentofClinicalHematology,theCollegeofClinicalLaboratoryScience，GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuiyangWomenandChildrenHospital,Guiyang550003,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore application value of quantitative detection of serum circulating DNA(cDNA) in diagnosing ovarian cancer. Methods: 252 cases of pathologically confirmed patients with epithelial ovarian cancer were enrolled as ovarian cancer group, 100 cases of patients with benign ovarian cancer as benign control group, and 100 healthy people as healthy control group. Micro-genomic DNA extraction kit was adopted to extract the serum circulating DNA from the three groups and Real-time fluorescence quantitative PCR was adopted to detect the serum cDNA level. Results: There was no significantly statistical difference in level of serum cDNA between benign control group and healthy control group. There was significantly statistical difference in level of serum cDNA between ovarian cancer group and benign control group or between ovarian cancer group and healthy control group(P<0.05). In different clinical stage epithelial ovarian cancer, there was no difference in level of serum cDNA. Conclusion: Quantitative detection of serum cDNA of patients with ovarian cancer might be a novel auxiliary method for diagnosis of ovarian cancer.

[Key words]serology; DNA; ovarian cancer; diagnosis technique and method

*[基金項目]貴州省科學技術基金[黔科合J字(2011)2233號]

[中圖分類號]R737.31； R737.33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0543-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.012

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2108.034.html