Cyclin D1和Ki-67在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及相關(guān)性*

陳國慶， 王興新， 訾　聃*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 婦產(chǎn)科, 貴州 貴陽　550004； 2.威寧縣人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 貴州 威寧　553100)

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Cyclin D1和Ki-67在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及相關(guān)性*

陳國慶1**， 王興新2， 訾聃1***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 婦產(chǎn)科, 貴州 貴陽550004； 2.威寧縣人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 貴州 威寧553100)

[摘要]目的： 探討細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和增殖細(xì)胞核抗原(Ki-67)在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及其與臨床病理間的關(guān)系。方法： 應(yīng)用EnVision免疫組化法對40例卵巢上皮性癌(觀察組)及10例卵巢良性腫瘤組織(對照組)進(jìn)行Cyclin D1和Ki-67表達(dá)水平檢測,比較Cyclin D1、Ki-67蛋白與卵巢癌的各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系及兩種蛋白間的關(guān)系。結(jié)果： 觀察組Cyclin D1陽性表達(dá)率和Ki-67過表達(dá)率高于對照組,觀察組Cyclin D1陽性表達(dá)率在FIGO分期和組織學(xué)分級病理參數(shù)下比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在年齡、組織學(xué)類型和淋巴轉(zhuǎn)移等病理參數(shù)下比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ki-67過表達(dá)率在FIGO分期方面比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Cyclin D1陽性表達(dá)率和Ki-67過表達(dá)率呈現(xiàn)正相關(guān)性(r=0.370，P<0.05)。結(jié)論： Cyclin D1和Ki-67在卵巢上皮性癌中的共同表達(dá)可能是促進(jìn)卵巢上皮性癌形成和發(fā)展的因素。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤； 細(xì)胞周期蛋白D1； 增殖細(xì)胞核抗原； 細(xì)胞周期； 免疫組織化學(xué)

卵巢癌是婦科臨床上常見惡性腫瘤類型，其發(fā)病率稍低于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但其惡性程度極高，死亡率在婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位居首位。卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)在卵巢癌中所占比例為85%～90%，好發(fā)年齡50～60歲，早期常無明顯癥狀。由于卵巢位居盆腔深部，早期癥狀不明顯，所以不易早期發(fā)現(xiàn)，因此常錯(cuò)過手術(shù)治療最佳時(shí)機(jī)[1]。臨床常規(guī)的腫瘤標(biāo)志物特異度和敏感度均不高，因此也影響卵巢癌的預(yù)后，降低遠(yuǎn)期生存率。故而積極探尋全新的較為理想的腫瘤標(biāo)志物對臨床診斷和治療均具有至關(guān)重要的作用。細(xì)胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1,Cyclin D1)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，Ki-67)在EOC組織細(xì)胞增殖和凋亡過程中具有重要調(diào)控作用，可引起細(xì)胞異常增殖，最終導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展[2]。但是目前關(guān)于兩種生物標(biāo)志物在卵巢上皮性癌不同臨床病理參數(shù)條件下的表達(dá)情況研究甚少。基于此，本研究通過檢測Cyclin D1和Ki-67在EOC中及不同臨床病理參數(shù)條件下的表達(dá)情況，確定二者表達(dá)的相關(guān)性，探討兩者在卵巢癌形成及發(fā)展中所起的作用。

1對象與方法

1.1臨床資料

收集2011年1月～2015年12月40例EOC患者手術(shù)蠟塊標(biāo)本(觀察組)，另選取同期手術(shù)的卵巢良性腺瘤10例(對照組)。所有患者臨床資料完整，手術(shù)標(biāo)本均送至病理科經(jīng)檢查證實(shí)且術(shù)前未接受過放、化療及免疫治療。觀察組年齡16～83歲，平均(49.37±10.25)歲。觀察組組織學(xué)類型，黏液性腺癌7例，漿液性腺癌33例；組織學(xué)分級，低分化12例，中分化24例，高分化4例；FIGO(2009年)分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期6例，Ⅲ期18例，Ⅳ期2例，7例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；對照組年齡17～69歲，平均(48.92±10.31)歲，組織學(xué)類型有漿液性囊腺瘤3例，黏液性囊腺瘤7例。

1.2方法

Cyclin D1兔抗人單克隆抗體、Ki-67鼠抗人單克隆抗體及EnVision試劑盒(均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司)；采用EnVision免疫組化法進(jìn)行，將選好的蠟塊，3 μm連續(xù)切片，每例切4張，取其中1張做蘇木素-伊紅(HE)染色，其余做免疫組化染色。一抗工作濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整，Ki-67、Cyclin Dl均為1∶100。免疫組化染色程序嚴(yán)格按照試劑盒說明方法染色，所有切片染色均在相同條件下進(jìn)行，每批染色均設(shè)陽性對照(試劑公司提供)和陰性對照(PBS代替一抗)。

1.3觀察指標(biāo)

Ki-67和Cyclin Dl于細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色反應(yīng)物顆粒為陽性細(xì)胞。陰性對照用PBS液分別代替一抗Cyclin D1、Ki-67；陽性對照，Cyclin D1、Ki-67采用乳腺癌切片作陽性對照。具體評分標(biāo)準(zhǔn)參照Fromowitz的綜合計(jì)分法進(jìn)行，首先是染色強(qiáng)度評分：無染色為0分；呈現(xiàn)淡黃色顆粒，明顯高于背景為1分；呈現(xiàn)淺棕黃色顆粒為2分；出現(xiàn)大量深棕黃色顆粒為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評分：每片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分；陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞數(shù)比例的評分相加之和<2為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)。弱陽、中陽、強(qiáng)陽均判為陽性，以中度陽性和強(qiáng)陽性為過表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)，兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)，不滿足χ2檢驗(yàn)條件時(shí)采用連續(xù)校正公式或FISH精確概率檢驗(yàn)法。相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析，以ɑ=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組卵巢腫瘤組織Cyclin D1和Ki-67表達(dá)

觀察組Cyclin D1陽性表達(dá)率和Ki-67過表達(dá)率較對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1及表1。

注：A、B為Cyclin D1，C、D為Ki-67；A、C為實(shí)驗(yàn)組中的強(qiáng)陽性表達(dá)，B、D為對照組中陰性表達(dá)和弱表達(dá)圖1　兩組卵巢腫瘤中Cyclin D1和Ki-67表達(dá)(EnVision,×20)Fig.1　Expression of Cyclin D1 and Ki-67 in ovarian tumor by immunohistochemistry method

組別nCyclinD1-++++++陽性率Ki-67-++++++過表達(dá)率觀察組40141411126(65.00)47101929(72.50)對照組1082002(20.00)71202(20.00)χ24.8757.263P0.0270.007

2.2Cyclin D1、Ki-67表達(dá)與臨床病理學(xué)

觀察組Cyclin D1陽性表達(dá)率在年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)類型方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在FIGO分期、組織學(xué)分級病理學(xué)參數(shù)條件下差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ki-67過表達(dá)率在年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級和組織學(xué)類型方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在FIGO分期方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2和表3。

表2　Cyclin D1表達(dá)與臨床病理學(xué)(n，%)

表3　Ki-67表達(dá)與臨床病理學(xué)(n，%)

2.3觀察組Cyclin D1和Ki-67表達(dá)相關(guān)性

觀察組中Cyclin D1的表達(dá)與Ki-67的過表達(dá)之間呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.370，P<0.05)，見表4。

表4　觀察組卵巢上皮性癌組織中Cyclin D1

3討論

EOC是女性常見的惡性腫瘤，其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明[3]。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞增殖失控和轉(zhuǎn)移是卵巢癌發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖受正向和負(fù)向兩種調(diào)節(jié)因素的影響，生理狀態(tài)下兩者處于平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，將導(dǎo)致疾病的發(fā)生。如果正向因素過表達(dá)，細(xì)胞無限增殖，最終導(dǎo)致癌癥[4]。Cyclin D1是細(xì)胞周期素家族中主要成員之一，可正向調(diào)控細(xì)胞周期。在正常細(xì)胞周期中，Cyclin D1只表達(dá)于G1期，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)形成過程中作用顯著，之后細(xì)胞增殖會迅速進(jìn)入S期，而 Cyclin D1蛋白將會在短時(shí)間內(nèi)降解[5-6]。在包括EOC在內(nèi)的惡性腫瘤組織中，Cyclin D1基因被激活并異常高表達(dá)，使得細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化被異常縮短，從而打破細(xì)胞增殖和凋亡平衡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生成。Ki-67是目前受醫(yī)學(xué)工作者普遍關(guān)注的另一項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物，Ki-67蛋白表達(dá)程度在細(xì)胞周期的各個(gè)階段都不同，在G1中期到后期開始表達(dá)，S期和G2期表達(dá)逐漸增加，M期達(dá)到高峰，當(dāng)有絲分裂結(jié)束后，迅速降解，半衰期僅為1 h或更短，被認(rèn)為是一種增殖細(xì)胞核抗原[7]。Ki-67在不同腫瘤組織中幾乎均有表達(dá)，因而在臨床中廣泛應(yīng)用以判斷細(xì)胞周期活性，鑒別良惡性腫瘤。cyclinD1和Ki-67同時(shí)表達(dá)已經(jīng)在各種各樣的腫瘤中發(fā)現(xiàn)；據(jù)有關(guān)研究資料報(bào)道，在EOC患者中，Cyclin D1和Ki-67陽性表達(dá)率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卵巢良性腺瘤，且在FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級等不同病理參數(shù)條件下表達(dá)情況均具有顯著差異，其中Ⅲ、Ⅳ期、低分化中陽性表達(dá)率更高，而與病理類型無關(guān);提示Cyclin D1和Ki-67對卵巢腫瘤良惡性的鑒別及對卵巢上皮性癌診斷、預(yù)后評價(jià)具有重要的參考價(jià)值，可用以判斷病情，參與輔助治療。

本研究結(jié)果顯示，觀察組Cyclin D1陽性表達(dá)率和Ki-67過表達(dá)率顯著高于對照組，提示兩者促進(jìn)了卵巢腫瘤惡變的過程。進(jìn)一步分析兩者在EOC中的表達(dá)與臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1陽性率在FIGO分期、組織學(xué)分級方面存在顯著差異，而與年齡、病理類型和有無淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)；Ki-67在FIGO分期方面具有顯著差異，與病理類型，有無淋巴轉(zhuǎn)移及組織分級無關(guān)；提示兩者均能促進(jìn)卵巢惡性腫瘤的增殖、浸潤。本研究結(jié)果顯示兩者在EOC中的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)，與姚俊閣、呂藝等[8-9]研究結(jié)果不符，可能與樣本量少或判斷標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，需擴(kuò)大樣本量及統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)EOC中Cyclin D1陽性表達(dá)率和Ki-67過表達(dá)率呈正相關(guān)，可能機(jī)制為Ki-67過表達(dá)促進(jìn)Cyclin D1正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤增殖，發(fā)展。

綜上，Cyclin D1和Ki-67可以參與輔助診斷EOC，隨著Cyclin D1陽性表達(dá)率升高，Ki-67過表達(dá)率也明顯升高，二者呈現(xiàn)正相關(guān)性共同促進(jìn)腫瘤生成和進(jìn)展，Cyclin D1和Ki-67同時(shí)異常高表達(dá)可打破細(xì)胞增殖和凋亡平衡，可能是卵巢上皮性癌發(fā)生和進(jìn)展病理基礎(chǔ)，兩者在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同作用，可輔助臨床診斷和為臨床治療提供靶點(diǎn)。

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(2016-01-01收稿，2016-04-10修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

Expression of Cyclin D1 and Ki-67 in Epithelial Ovarian Cancer and Expression Correlation

CHEN Guoqing1, WANG Xingxing2, ZI Dan1

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,WeiningCountyPeople'sHospital,Weining553100,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the expression of Cyclin D1 and Ki-67 in epithelial ovarian cancer and the correlation between their expression and clinical pathology. Methods: EnVision immunohistochemical assay kit was adopted to detect the expression level of Cyclin D1 and Ki-67 protein in 40 cases of patients with epithelial ovarian cancer (observation group) and 10 cases of patients with benign ovarian tumors (control group). The relationship between Cyclin D1 protein expression level and Ki-67 protein expression level was also observed and compared.Results: The positive expression rate of Cyclin D1 and the over-expression rate of Ki-67 in observation group were higher than those in control group. There were statistical differences in positive expression rates of Cyclin D1 between observation group and control group when compared in terms of pathological parameters such as FIGO clinical staging and histological grading(P<0.05), but there were no statistical differences between observation group and control group when compared in terms of pathological parameters such as age, histological type and lymph node metastasisin (P>0.05). There were statistical differences in over-expression rates of Ki-67 between observation group and control group when compared in terms of FIGO clinical staging(P<0.05). The data showed that the positive expression rate of Cyclin D1 and the over-expression rate of Ki-67 was positively correlated (r=0.370, P<0.05). Conclusion: Co-expression of Cyclin D1 and Ki-67 in epithelial ovarian cancer may be the factors that promote the pathogenesis and progression of epithelial ovarian cancer.

[Key words]ovarian tumor; Cyclin D1; proliferating cell nuclear antigen; cell cycle; immunohistochemistry

*[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳聯(lián)合基金[黔科合LG 字(2011) 032 號]

[中圖分類號]R737.31

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0539-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.011

**貴州醫(yī)科大學(xué)2015級同等學(xué)歷碩士研究生，現(xiàn)工作于威寧縣人民醫(yī)院

***通信作者 E-mail:2816497455@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2057.026.html