鈦表面構(gòu)建成骨細胞膜片的體外研究*

毛久鳳， 夏　茜， 吳　鐳， 楊　紅， 周成菊， 方　藝， 董　強

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔內(nèi)科， 貴州 貴陽　550004； 3.貴陽市口腔醫(yī)院， 貴州 貴陽　550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室， 貴州 貴陽　550004； 5.貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔修復(fù)學(xué)教研室， 貴州 貴陽　550004)

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鈦表面構(gòu)建成骨細胞膜片的體外研究*

毛久鳳1， 夏茜2， 吳鐳1， 楊紅3， 周成菊3， 方藝4， 董強5**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔內(nèi)科， 貴州 貴陽550004； 3.貴陽市口腔醫(yī)院， 貴州 貴陽550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004； 5.貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔修復(fù)學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究成骨細胞膜片在鈦表面的生長情況。方法： 將體外培養(yǎng)鑒定的的大鼠成骨細胞接種在純鈦表面，構(gòu)建大鼠成骨細胞膜片，連續(xù)培養(yǎng)1、2、3周，分別于第1、2、3周末收集成骨細胞膜片，倒置顯微鏡下觀察細胞膜片的組成，光鏡測量各時間點細胞膜片的厚度。結(jié)果： 原代培養(yǎng)細胞符合成骨細胞形態(tài)學(xué)特征；第2、3周末細胞膜片厚度較第1周末細胞膜片厚度明顯增加(P<0.05)；與第3周末細胞膜片相比，第2周末細胞膜片厚度增加最明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 鈦表面構(gòu)建的成骨細胞膜片擁有良好的增殖生長活性。

[關(guān)鍵詞]成骨細胞； 鈦； 組織工程； 細胞膜片

由于外傷、牙周疾病等因素導(dǎo)致的種植術(shù)區(qū)牙槽骨骨缺損，給缺牙區(qū)的種植修復(fù)帶來了困難且修復(fù)失敗率高?；诮M織工程方法促進骨組織再生、恢復(fù)其結(jié)構(gòu)與功能已引起人們廣泛的關(guān)注。傳統(tǒng)的組織工程方法利用細胞與支架的直接復(fù)合，出現(xiàn)細胞活性差、細胞利用率低等缺點。隨著組織工程無支架細胞膜片技術(shù)(cell sheet technology，CST)的不斷發(fā)展，利用細胞與細胞外基質(zhì)聚合物再生組織的方法，一定程度上有效的解決了細胞流失的問題。該技術(shù)已成功應(yīng)用于構(gòu)建皮膚、角膜、牙周膜等多種組織[1-4]。鈦作為可供選擇的植入材料，與宿主骨之間具有良好的生物相容性，但其生物惰性使鈦與宿主骨之間短時間內(nèi)難以形成很好的骨整合，構(gòu)建具有成骨活性的細胞膜片，對植體周圍快速成骨、縮短骨愈合時間具有重要的臨床指導(dǎo)意義[5]。目前尚未見有關(guān)鈦表面構(gòu)建細胞膜片的報道。本實驗旨在鈦表面構(gòu)建大鼠成骨細胞膜片，從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)觀察不同時間段細胞膜片的厚度，初步評估其在鈦表面的生物學(xué)變化。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自美國HyClone公司，胎牛血清購自浙江杭州四季青公司，Ⅰ型膠原酶購自美國Gibco公司，抗壞血酸購自美國Solarbio-Sigma-Ultra公司，超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、離心機及倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)購自美國Corning-Costar公司，鈦片由陜西省西安泰金工業(yè)電化學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)，SD大鼠乳鼠購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1大鼠成骨細胞的培養(yǎng)及鑒定新生24 h內(nèi)SD大鼠乳鼠于無菌超凈臺內(nèi)剝離顱骨，預(yù)冷的PBS液洗3次后，刮凈骨膜結(jié)締組織，剪碎骨片。加入胰蛋白酶(含0.25% EDTA)消化約15 min，棄消化液；0.1%Ⅰ型膠原酶2 mL，于37 ℃消化20 min，重復(fù)消化3次，收集消化液，1 000 r/min離心5 min，棄上清；沉淀制成細胞懸液，差數(shù)貼壁法純化，用含有15 %胎牛血清的DMEM的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液1次。細胞融合單層鋪滿瓶底約80%～90%進行傳代培養(yǎng)，傳至3代。從形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶染色、茜蘇紅染色對細胞進行鑒定。

1.2.2鈦片的準備準備厚約1 mm，直徑3.5 cm的2級純鈦片，以不同粗糙度的金相砂紙打磨表面、拋光后呈鏡面，丙酮超聲清洗180 min，之后依次使用75 %酒精、去離子水清洗15 min，置于空氣中自然干燥，實驗前高壓滅菌。

1.2.3構(gòu)建大鼠成骨細胞膜片第3代成骨細胞以2×106個/孔的細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)鈦表面，用DMEM高糖培養(yǎng)基(含15%胎牛血清、50 mg/L抗壞血酸及100 U/mL青霉素-鏈霉素)連續(xù)培養(yǎng)3周，培養(yǎng)基每2 d更換1次。

1.3觀察指標

分別于細胞膜片培養(yǎng)的第1、2、3周末時，用細胞刮將其小心的分離鈦表面，置于PBS里倒置相差顯微鏡下觀察；然后置于4 %的多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，進行HE染色，光鏡下觀察細胞膜片的形態(tài)及組成。用Image-Pro Plus圖像分析軟件(200倍視野，圖像尺寸1 280×1 024)采集各時間點細胞膜片的組織學(xué)切片圖像，同樣像素和視野下設(shè)置標尺，隨機選取5個點，根據(jù)標尺測量其厚度并取平均值，此值為膜片的厚度。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1大鼠成骨細胞形態(tài)

原代培養(yǎng)的細胞呈圓形類圓形，5 h后有部分細胞貼壁，貼壁細胞呈梭形、星形。第7～8天時后有細胞集落生長，融合成片，細胞鋪滿瓶底即可傳代。堿性磷酸酶染色檢測陽性，符合成骨細胞的生物學(xué)特性。連續(xù)培養(yǎng)21 d，茜蘇紅染色出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)。見圖1。

2.2大鼠成骨細胞膜片

細胞膜片培養(yǎng)第1、2及3周末均可觀察到鈦表面形成薄層乳白色膜狀物，利用細胞刮可將成骨細胞膜片從鈦表面分離(圖2A)，膜片有一定韌性，可收縮成團，具有一定的操作性。將膜片置于倒置顯微鏡下觀察膜片層由細胞和細胞外基質(zhì)形成，細胞間連接緊密(圖2B)。

2.3成骨細胞膜片厚度

細胞膜片厚度測量結(jié)果(如圖3)，第1周末(13.336 1±0.455 51)μm，第2周末(27.759 5±0.444 88)μm，第3周末(34.768 2±0.399 78)μm,第2周末和第3周末的膜片厚度逐漸增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示通過在純鈦表面高密度接種的成骨細胞，用含有抗壞血酸的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)，可形成膜片層結(jié)構(gòu)，且隨時間的增加膜片厚度增加，其中第2周膜片厚度增加最明顯。

注：A為原代成骨細胞，B為HE染色，C為堿性磷酸酶染色，D為茜蘇紅染色圖1　大鼠成骨細胞形態(tài)(100×)Fig.1　Morphological characteristics of osteoblasts of rats

注：A為大體觀，B為鏡下觀圖2　大鼠成骨細胞膜片(100×)Fig.2　Osteoblast cell sheets of rats

注： A(200×)和B(400×)為培養(yǎng)第1周末膜片，C(200×)和D(400×)為培養(yǎng)第2周末膜片，E(200×)和F(400×)為培養(yǎng)第3周末膜片圖3　培養(yǎng)不同時間的成骨細胞膜片(HE)Fig.3　Osteoblast cell sheet cultured in different time

3討論

相較于傳統(tǒng)的組織工程方法，CST作為一種新型的組織再生技術(shù)，具有細胞利用率高、無組織排斥反應(yīng)等優(yōu)點，細胞膜片結(jié)構(gòu)保留了一些重要的細胞表面蛋白如細胞生長因子受體、細胞-細胞連接蛋白等可通過溫度反應(yīng)培養(yǎng)皿法、物理刮取法等方法獲得完整的膜片結(jié)構(gòu)，由于膜片結(jié)構(gòu)保留了細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)間連接，它可同一時間將大量細胞移植到受體區(qū)，移植細胞活性和生理功能及結(jié)構(gòu)的完整性受到保護[6]。本研究采用CST的方法，利用成骨細胞在鈦表面構(gòu)建了大鼠成骨細胞膜片，研究發(fā)現(xiàn)，利用抗壞血酸成骨誘導(dǎo)后的成骨細胞在鈦表面培養(yǎng)5～7 d，即能形成薄層膜狀物，膜片內(nèi)細胞隨機排列并重疊生長，細胞間充滿細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，膜片結(jié)構(gòu)能很好的黏附于鈦表面，并且可以在鈦表面維持至少2～3周。鈦材料與周圍環(huán)境的整合過程需要細胞的粘附、增殖、分化等行為。成骨細胞增殖、分化的前提是細胞的黏附。不同于其它金屬，金屬鈦表面可以對一些大分子物質(zhì)的吸附來調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)行為。有研究提示采用ECM蛋白處理的鈦表面促進了成骨細胞的增殖、分化[7]。ECM蛋白的存在影響細胞的黏附能力，鈦表面大量細胞與細胞外基質(zhì)間的反應(yīng)對調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號通路、細胞的黏附、增殖很重要[8-10]。本實驗前期已對體外構(gòu)建的成骨細胞膜片有一定研究，其主要成分是細胞及細胞自分泌的細胞外基質(zhì)蛋白，現(xiàn)對成骨細胞膜片在鈦表面的生物學(xué)變化評估提示，豐富的ECM蛋白可以增強膜片結(jié)構(gòu)在鈦表面的黏附能力，ECM作為細胞自身的細胞外支架有利于維持細胞的穩(wěn)定、促進細胞間的連接，便于細胞間信息的溝通。細胞膜片通過ECM的黏附與周圍環(huán)境相互作用影響細胞的功能。本實驗通過測量鈦片上細胞膜片的厚度結(jié)果顯示，借助細胞刮將膜片與鈦表面分離，組織學(xué)對其厚度分析，誘導(dǎo)過程中隨著時間的延長，膜片厚度增加，其中第2周末和第3周末較第1周末厚度明顯增加，提示通過在純鈦表面高密度接種的成骨細胞，用含有抗壞血酸的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)，可形成膜片層結(jié)構(gòu)，且隨時間的增加膜片厚度增加；與第3周末比較，第2周末膜片厚度增加最明顯，細胞膜片在鈦表面培養(yǎng)2周，增殖能力降低，有可能膜片內(nèi)細胞開始進入分化階段。提示在鈦表面構(gòu)建的成骨細胞膜片能很好的與鈦表面形成接觸，并且在表面生長增殖，這可能與細胞的發(fā)育需要生長因子和細胞因子等細胞信號分子的激發(fā)完成，而這些信號分子能夠募集細胞，誘導(dǎo)細胞的增殖、分化[11]。綜上，本研究應(yīng)用細胞和細胞外基質(zhì)膜片技術(shù)在鈦表面構(gòu)建的由多層細胞聚集形成的細胞膜片模擬了體內(nèi)骨基質(zhì)的形成過程。在鈦表面，成骨細胞膜片仍然存在細胞增殖活性。

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(2016-01-06收稿，2016-03-18修回)

中文編輯： 戚璐； 英文編輯： 劉華

Studyinvitroof Osteoblast Cell Sheet on Titanium Surface

MAO Jiufeng1, XIA Qian2, WU Lei1, YANG Hong3, ZHOU Chengju3, FANG Yi4, DONG Qiang5

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofOralMedicine,theAffiliatedStomatologicalHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 5.DepartmentofProsthodontics,StomatologicalCollegeofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the growth activity of osteoblast cell sheet on the titanium surface. Methods: Rats' osteoblasts were cultured in vitro and identified. Then osteoblast cell sheets were vaccinated on the titanium surfaces and cultured for 1 week, 2 weeks and 3 weeks. At different designated time points the cell-sheets were collected with a cell scraper and its structure and composition were examined under the inverted microscope, and the thickness of the cell sheet was measured by light microscope. Results: The cells on cell sheet were consistent with the morphological characteristics of osteoblasts, suggesting the cell sheets were successfully constructed on the titanium surface. The results showed that the thickness of the cell sheet significantly increased at 2ndweek and 3rdweek after culture compared with at the 1stweek(P<0.05). The thickness of the cell sheet increased more significantly at the 2ndweek compared with at the 3rdweek (P<0.05). Conclusion: The osteoblast cell sheets on the titanium surface have a good proliferation activity.

[Key words]osteoblast; titanium; tissue engineering; cell sheet

*[基金項目]貴州省科技廳省校合作協(xié)議項目[黔科合LH字(2014)7115號]； 貴陽市科技計劃項目[筑科合同(20141001)39號]

[中圖分類號]R318.021

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0535-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.010

**通信作者 E-mail:dongq666@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2030.016.html