冷凍胚胎印記基因H19的DNA甲基化狀態研究*

施曉鋆， 陳士嶺， 鄭海燕， 王樂樂， 吳雅琴

(1.貴陽市第二人民醫院 婦產科， 貴州 貴陽　550081； 2.南方醫科大學南方醫院 婦產科生殖中心， 廣東 廣州　510515)

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冷凍胚胎印記基因H19的DNA甲基化狀態研究*

施曉鋆1， 陳士嶺2， 鄭海燕2， 王樂樂2， 吳雅琴2

(1.貴陽市第二人民醫院 婦產科， 貴州 貴陽550081； 2.南方醫科大學南方醫院 婦產科生殖中心， 廣東 廣州510515)

[摘要]目的： 比較研究常規慢速冷凍和玻璃化冷凍后的人類早期胚胎印記基因H19的DNA甲基化狀態，初步了解低溫冷凍對胚胎基因印記的影響。方法： 收集胚胎移植術后正常受精的低質量的第3天胚胎152個，進行冷凍、復蘇，其中常規慢速冷凍胚胎78個，玻璃化冷凍胚胎74個，另收集70個新鮮未冷凍胚胎作為對照；記錄3種類型單個胚胎Bisulfite-PCR擴增個數，采用結合重亞硫酸鹽限制性酶分析法檢測胚胎印記基因H19的DNA甲基化狀態。結果： 慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚胎及新鮮未冷凍胚胎的單個胚胎Bisulfite-PCR擴增分別成功40、53、58個；慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚胎及新鮮未冷凍胚胎H19基因的平均甲基化程度分別為(44.8±6.4)%、(47.5±5.6)%及(46.7±6.0)%，異常甲基化率分別為10.0%(4/40)、13.2%(7/53)及3.4%(2/58)；3組胚胎的甲基化程度和異常甲基化率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論： 低溫冷凍不增加人類胚胎甲基化異常的發生率。

[關鍵詞]胚胎研究； 胚胎移植； 甲基化； 生殖技術,輔助； 印記基因，H19； 慢速冷凍； 玻璃化冷凍

輔助生殖技術(ART)不同于自然妊娠的過程，較多的學者關注ART出生后代的甲基化等表觀遺傳學風險。有研究認為卵細胞、早期胚胎是DNA甲基化易于變化的敏感時期，藥物促排卵、體外培養等技術環節可能影響甲基化的擦除、重建和維持，從而誘發配子、胚胎出現印記基因甲基化異常[1]。國外的一些流行病學研究也報道ART子代可能有較高的基因印記疾病發病率，例如Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS)和Angelman綜合征(AS)[2]。BWS、AS的發病涉及染色體11p15區域的一系列印記基因，其中H19基因研究得較為成熟[3-4]。胚胎冷凍是輔助生殖臨床常規開展的技術，主要包括慢速冷凍和玻璃化冷凍(vitrification)2種方法。低溫、冷凍保護劑毒性等因素一直受到各種研究的關注，而有關冷凍技術對胚胎基因印記影響的研究較少，且局限在動物實驗。研究冷凍技術對人類胚胎基因印記的影響有助于評價ART技術的安全性。本研究收集人類第3天(Day3)冷凍胚胎和新鮮未冷凍胚胎，檢測并比較印記基因H19的DNA甲基化狀態，初步探討冷凍技術對胚胎基因印記的影響。

1材料與方法

1.1研究對象

本研究經醫院倫理委員會批準。選擇常規體外受精(IVF)或者卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)治療的患者，經知情同意后收集患者選擇丟棄的低質量Day3胚胎。冷凍復蘇胚胎為胚胎移植術后收集正常受精(2PN)的低質量的Day3胚胎進行常規慢速冷凍或玻璃化冷凍保存，其中慢速冷凍胚胎78個，玻璃化冷凍胚胎74個，分別解凍后用于印記基因甲基化分析。收集胚胎移植術后70個正常受精(2PN)的低質量Day3的新鮮未冷凍胚胎作為對照。

1.2方法

1.2.1胚胎的冷凍和復蘇胚胎的慢速冷凍復蘇采用試劑盒Quinns Advantage Embryo Freeze Kit 和Quinns Advantage Thaw Kit (Sage, Pasadena, CA, USA)，按說明書進行操作。玻璃化冷凍復蘇以冷凍環為胚胎載體，冷凍保護劑使用丙二醇和乙二醇，按照文獻[5]方案步驟進行操作。

1.2.2H19甲基化狀態檢測采用結合重亞硫酸鹽的限制性酶分析(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)法對單個胚胎進行DNA甲基化分析[6]：(1)使用低熔點瓊脂糖(LMP)，配合CpGenome DNA Modification Kit (Chemicon International, Temecula, CA)對胚胎細胞DNA進行Bisulfite轉化；(2)以轉化的DNA為模板進行PCR擴增(H19基因 Genbank號為AF125183, 起止位置為7870～8100)，上游引物F1為5′- AGGTGTTTTAGTTTTATGGATGATGG -3′，上游引物F2為5′-TGTATAGTATATATATGGGTATTTTTGGAGGTTT -3′，下游引物R為5′-TCCTATAAATATCCTATTCCCAAATAACC-3′；(3)PCR產物為230 bp片段(代表母系非甲基化等位基因)或130 bp和100 bp片段(代表父系甲基化等位基因)，甲基化程度為130 bp和100 bp條帶灰度的百分比。正常胚胎應同時具有母系和父系H19等位基因，甲基化程度約為50%。采用TaqI酶切后，以4%瓊脂糖凝膠電泳分離(電壓為110 V，時間30 min)，電泳結束后采用GAS76WL-T20凝膠成像系統拍照。甲基化狀態分析采用Labworks image acquisition and analysis software (Ultra-violet Products, Ltd., Cambridge, UK) 對凝膠圖片進行灰度掃描計算。

1.3統計學分析

2結果

2.1單個胚胎Bisulfite-PCR擴增結果

3種類型的胚胎PCR成功率顯著不同(χ2=17.58，P=0.000)。慢速冷凍胚胎的PCR成功率低于新鮮胚胎(χ2=16.44，P=0.000)和玻璃化冷凍胚胎(χ2=6.61，P=0.01)； 玻璃化冷凍胚胎與新鮮胚胎的PCR成功率比較，差異無統計學意義(χ2=2.57，P=0.10)。見表1、圖1。

2.2H19 基因DNA甲基化程度與甲基化率

慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚胎及新鮮未冷凍胚胎H19基因的平均甲基化程度比較，差異無統計學意義(P=0.127)，見表2。慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚胎及新鮮未冷凍胚胎H19基因的異常甲基化發生率比較，差異無統計學意義(χ2=3.48，P=0.175)，見表3。

表1　3種類型的單胚胎bisulfite-PCR的擴增結果

注： Slow-freezing embryos所示為慢速冷凍胚胎檢測結果，15、16、39及42號胚胎僅出現230 bp，為母系非甲基化片段，屬異常低甲基化狀態(甲基化程度為0%)，其余胚胎為正常甲基化狀態；Vitrified embryos所示為玻璃化冷凍胚胎檢測結果，7號胚胎的甲基化程度為8.7%(甲基化片段明顯弱)，為異常低甲基化；14、28、35及37號胚胎僅出現230bp的非甲基化片段，為異常低甲基化狀態(甲基化程度為0%)。圖1　慢速冷凍及玻璃化冷凍胚胎H19甲基化結果(COBRA)Fig.1　The COBRA results for frozen embryos in slow-freezing and vitrification freezing

胚胎類型nH19甲基化程度(%)慢速冷凍3644.8±6.4玻璃化冷凍4547.5±5.6新鮮未冷凍5646.7±6.0

表3　3種類型胚胎H19基因的異常甲基化率

3討論

低溫冷凍對早期胚胎的影響一直存在爭議，冷凍后胚胎的基因表達、細胞凋亡等方面已有較多研究。早期胚胎植入前容易發生甲基化的改變，H19基因屬于父系甲基化印記基因，全長3 kb，共含有5個外顯子，4個內含子。動物實驗發現玻璃化冷凍后的小鼠胚胎出現H19基因甲基化狀態異常和表達量的顯著增加，提示冷凍技術可能影響DNA甲基化狀態[7]。

本研究中僅有51.3%的慢速冷凍胚胎能成功的通過bisulfite-PCR擴增分析，其原因可能是慢速冷凍產生的冰晶對細胞造成了機械性損害。玻璃化冷凍由于不產生冰晶，對細胞的機械性破壞小，因而PCR成功率與新鮮胚胎無顯著差別。由于溫度、pH值以及培養液營養成分等因素，體外培養的早期胚胎存在一定比例的甲基化異常[8]。本研究亦發現3.4%的新鮮胚胎出現H19甲基化異常；慢速冷凍、玻璃化冷凍胚胎H19基因甲基化異常率分別為10.0%、13.2%，與新鮮胚胎比較無顯著差別(P=0.175)；定量分析提示3組胚胎的H19基因甲基化程度亦無顯著差別(P=0.127)。

DNA甲基化的建立和維持是依賴DNA甲基化轉移酶類(DNA methyltransferases, Dnmts)和甲基化結合蛋白(methyl-binding domain proteins)[8-10]。推測體外培養環境、冰晶、高濃度保護劑等因素可能影響了Dnmts的活性，從而導致胚胎出現甲基化異常。冷凍胚胎與新鮮胚胎比較，甲基化異常率無統計學差別，初步認為冷凍操作可能不增加胚胎甲基化異常的發生率，但冷凍胚胎的甲基化異常率有增高的趨勢，需要擴大樣本量，擴展基因種類進一步研究。

本研究檢測的胚胎為不適合移植的低質量胚胎。低質量的胚胎一般作放棄處理，但在臨床實踐中，缺乏優質胚胎的情況下，部分患者仍會選擇質量差的胚胎進行移植。低質量胚胎獲得妊娠的機率較低，且出生子代的健康狀況尚未見系統的研究報道，根據本研究的結果可初步推測，使用低質量胚胎可能會增加子代印記缺陷的風險。

4參考文獻

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(2015-12-15收稿，2016-04-23修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

Research of DNA Methylation Status of Frozen Embryonic ImprintingH19 Gene

SHI Xiaoyun1, CHEN Shiling2, ZHENG Haiyan2, WANG Lele2, WU Yaqin2

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theSecondPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550081,Guizhou,r">China; 2.Reproductivecenter,DepartmentofGynaecologyandObstetrics,NanfangHospitalofSouthernmedicalUniversity,Guangzhou510515,Guangdong,China)

[Abstract]Objective: To investigate the DNA methylation status of human early embryonic imprinting H19 gene after slow-freezing or vitrification freezing, and preliminarily explore the effect of low temperature freezing on embryonic imprinting gene. Methods: 152 Day3-embryos (2PN, bad quality) with normal fertilization after embryo transplantation were collected and underwent freezing and resuscitation, of which 78 embryos were conducted by slow-freezing, 74 embryos by vitrification freezing. Besides, 70 fresh non-frozen embryos were collected as controls. The number of Bisulfite-PCR amplification of a single embryo was recorded in the three types. The Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) was used to determine H19 methylation status after embryos thawing. Results: The number of Bisulfite-PCR amplification of a single embryo in the three groups was 40 (slow-freezing), 53 (vitrification freezing) and 58 (fresh non-frozen), respectively. The average degree of H19 methylation in the three groups was (44.8±6.4)% (slow-freezing), (47.5±5.6)% (vitrification freezing) and 46.7%±6.0% (fresh non-frozen), respectively. The rate of abnormal methylation was 10.0% (slow-freezing), 13.2% (vitrification freezing) and 3.4% (fresh non-frozen), respectively. There was no statistical difference of H19 methylation degree and rate of abnormal methylation between three groups. Conclusion: The freezing technique may not increase the incidence of abnormal methylation in human embryos.

[Key words]embryo research； embryo transplantation; methylation; reproductive technology,auxiliary; imprinted genes,H19; slow-freezing; vitrification freezing

*[基金項目]國家自然科學基金項目(81460237)

[中圖分類號]R714.8

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0524-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.007

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2129.048.html